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本文首次对玉米弯孢叶斑病菌毒素的离体产生条件、基本特性、专化性特点、毒素对寄主细胞质膜的伤害机制及活性成份分离、纯化技术及化学结构进行了系统的研究。为了解玉米弯孢叶斑病菌毒素的致病机理、不同品种玉米的抗性反应及毒素活性物质的化学成份,从而为玉米抗病育种和科学利用玉米弯孢叶斑病菌毒素是提供可靠的理论基础。具体的研究结果如下:
首次对玉米弯孢叶斑病菌毒素的产生条件进行研究,得到最佳培养条件:(1)玉米弯孢叶斑病菌在几种供试培养基中,在改良Fries培养基产毒能力最强;(2)玉米弯孢菌在25℃时培养液的毒力作用最大;(3)当培养液的pH为8时,弯孢菌产毒能力最强;(4)光暗交替、振荡培养的状态下产毒最佳;(5)产毒的最佳时间为20d。这些条件与其菌丝生长、产孢有一定差异,表明玉米弯孢叶斑病菌的生长与产毒条件并不完全一致。
玉米弯孢叶斑病菌毒素粗提液的基本特性研究显示:(1)毒素粗提液在60℃和100℃的温度下处理一段时间后仍有生物活性;(2)当用甲醇处理毒素粗提液后,非蛋白部分具有致病活性,据此可以玉米弯孢叶斑病菌毒素为一类极性较大的非蛋白类物质;(3)该毒素对光不敏感,在用光照处理后仍具有活性;(4)用不同的有机溶剂萃取后,萃取浓缩液的生物活性非常小,因此在分离毒素时,不宜采用萃取的方法。毒素这些基本性质的揭示为分离纯化毒素提供了可靠的依据。
玉米弯孢叶斑病菌毒素致病机理的研究:(1)毒素处理不同抗性的玉米品种,细胞外渗液的电导率值有很大差别,抗病品种的电导率值明显低于感病品种;而且处理时间越长,细胞膜的透性越大;(2)用细胞中MDA的含量,表示膜脂过氧化程度,抗病品种的MDA值较低(0.42/24h),感病品种的MDA值较高(0.79/24h)。从而可以说明抗病品种细胞膜脂过氧化程度低,对毒素具有抗性,这也是抗病性在细胞膜上的反应。(3)毒素对寄主防御酶系的影响,可以看出处理植株体内的酶活性明显高于对照;抗病品种酶活性要高于感病品种,酶活性迅速被毒素激发。
毒素分离纯化及化学结构的研究表明:(1)通过对薄层层析展开剂的筛选,得出正丁醇:甲醇:水(60:15:30)为最佳展开剂。(2)通过洗脱曲线确定最佳柱层析的填料,kp-18硅胶(50μ)为最佳填料,培养液的各组分得以分离。(3)Rp-18硅胶柱反复柱层析,不同浓度的甲醇水溶液为洗脱液进行梯度洗脱,最后结晶和重结晶得到毒素的纯物质。在分离过程中,每一步都要以生物测定结果为标准。毒素的结构分析研究:(1)通过紫外光谱的测定,该毒素在216nm处存在最大吸收峰。 (2)红外光谱的结果显示,该化合物中可能存在-OH、-CH、-CH<,2>、-CH<,3>、C-O、-C-N等官能团,1464 cm<-1>:亚甲基的剪式振动吸收峰,因为这些吸收峰强度较大,所以推测结构中含有较多-CH<,2>基团。(3)质谱谱图中可见多个具有m/z为14的碎片,221-207、147-133、89-75等,推测结构中可以产生较多的CH<,2>碎片。(4)核磁共振的碳谱中可见2个连氧sp3杂化碳信号(δ 69.1,66.7),可以认为是醚键的两个直接相连C信号;在高场区可见重叠的sp3杂化碳信号,认为是长链烃基的C信号。根据以上信息,推测该化合物为一脂肪族醚类化合物。
毒素除草活性的研究: (1)玉米弯孢叶斑病菌毒素不仅对玉米种子的萌发有抑制作用,而且对杂草种子的萌发也有不同程度的抑制作用,说明该毒素为非寄主专化性毒素。(2)该毒素对黄瓜种子的萌发略有抑制作用,对水稻、白菜、罗卜都是安全的。(3)毒素不仅可以抑制杂草种子的萌发,而且对杂草幼苗有致萎作用。因此本研究表明该毒素具有一定的除草能力,为今后开发生物除草剂的先导化合物提供了生物学依据。