目的：弥漫性轴索损伤(Diffuse axonal injury，DAI)是一种原发性弥漫性脑损伤，是最重要的脑创伤类型之一，是引起死亡、严重致残及植物生存的主要原因。β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein，β-APP)的免疫组织化学染色是诊断DAI的金标准。正常情况下微量的β-APP沿着轴索通过快速顺行轴浆运输至突触。β淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)是β-APP通过蛋白水解作用后产生的一段淀粉样肽。当轴索发生损伤后，轴浆运输中断，从而导致β-APP的积聚并在轴突和胞体中大量表达，大量的Aβ由于β-APP酶解作用的上调而聚集在神经元的核周体，聚集的Aβ具有毒性作用，并可以激活小胶质细胞。　　大量研究己证实，DAI后的神经损害不仅发生在损伤瞬间，且在其后的数分钟到数天内还可出现神经元延迟性死亡。目前关于理解DAI发病过程相关的病理级联反应已经有了明显的进展，然而其形成机制尚不完全明确，是法医学和神经科学亟待解决的难题。在DAI的发病过程中，不仅表现为外力直接作用引起的神经元受损和死亡，同时也存在神经元凋亡，细胞凋亡不仅参与了DAI，而且可能在DAI的发生发展过程中扮演着重要的角色。Caspase-3属半胱天冬蛋白酶家族的一员，又被称作死亡蛋白酶，caspase-3的活化是损伤诱导凋亡的最后共同通路。实验研究中，多以caspase-3作为研究指标来评价细胞的凋亡。　　前期研究表明，在体状态下DAI大鼠脑皮质和海马神经元轴突中有β-APP的积聚，在损伤的轴索周围观察到小胶质细胞的聚集和活化，活化的小胶质细胞可以产生大量的炎症因子，引发神经元的“二次损伤”，导致神经元凋亡。然而，离体状态下，Aβ激活的小胶质细胞释放的TNFα和IL-1β是否可以引发大脑皮质神经元凋亡，进而参与神经元的“二次损伤”及其具体机制，尚未见详细报道。　　因此，本实验采用Aβ1-40作用于原代培养的小胶质细胞，应用ELISA和Real Time PCR的方法，通过检测TNFα和IL-1β含量及其mRNA的表达观察小胶质细胞活化情况；用激活的小胶质细胞条件培养基培养大脑皮质神经元，应用Real Time PCR和Hoechst33258染色的方法分别检测神经元caspase-3 mRNA的表达和神经元的凋亡率，以探讨DAI后小胶质细胞的活化引起神经元损伤的可能机制，为进一步阐明DAI病理生理学机制奠定基础，为法医学实际检案工作中对DAI损伤的客观评价提供理论依据。　　方法：　　1原代培养新生24h内SD乳鼠大脑皮质小胶质细胞，用Aβ1-40处理小胶质细胞，随机分为4组：对照组、Aβ处理组、Aβ+MC组和MC组。对照组不加处理因素，Aβ处理组加入1μMAβ1-40作用于小胶质细胞6h，Aβ+MC组在加入Aβ1-40前30min加入0.2μM米诺环素(Minocycline，MC)，MC组只加入0.2μM MC。ELISA法检测细胞培养上清中TNFα和IL-1β的含量，Real Time PCR检测细胞中TNFα和IL-1β mRNA的表达。　　2原代培养新生24h内SD乳鼠大脑皮质神经元，随机分为4组：对照组、1/2 Aβ-MCM组、1/4 Aβ-MCM组、1/8 Aβ-MCM组。对照组神经元正常培养，1/2 Aβ-MCM组、1/4 Aβ-MCM组、1/8 Aβ-MCM组分别在神经元培养基中加入1/2、1/4、1/8 Aβ激活的小胶质细胞条件培养基(Aβactivated microglia conditioned media，Aβ-MCM)，每组包括5个不同时相：1h、3h、6h、12h、24h。Real Time PCR检测各组细胞中caspase-3 mRNA的表达。选取1/2 Aβ-MCM组，采用Hoechst33258染色，观察神经元的凋亡率。　　用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据用均数±标准差(Mean±SD)表示。各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，以最小显著差法(least significant difference，LSD)作两两比较，以P＜0.05为有显著性差异。　　结果：　　1 Aβ1-40对小胶质细胞的作用及米诺环素对其作用的影响　　应用1μMAβ1-40作用于小胶质细胞6h后，细胞培养上清中TNFα和IL-1β的含量明显升高，与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)；加入0.2μM米诺环素和Aβ1-40共同作用于小胶质细胞后，明显抑制了TNFα和IL-1β的升高，与Aβ处理组相比明显下降。　　应用1μM Aβ1-40作用于小胶质细胞6h后，小胶质细胞中TNFα、IL-1βmRNA的表达明显升高，与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)；加入0.2μM米诺环素和Aβ1-40共同作用于小胶质细胞后，明显抑制了TNFα、IL-1β mRNA的表达，与Aβ处理组相比明显下降。　　2 Aβ-MCM对神经元caspase-3 mRNA表达的影响　　在神经元培养基中加入1/2量的Aβ-MCM后，各时间点神经元caspase-3 mRNA的表达均升高，与对照组相比均有显著性差异(P＜0.05)，其中以6h时升高最明显(P＜0.01)。在神经元培养基中加入1/4量和1/8量的Aβ-MCM，各时间点神经元caspase-3 mRNA的表达与对照组相比均无显著性差异。　　3 Aβ-MCM对神经元凋亡率的影响　　应用Hoechst33258染色观察神经元的凋亡率，结果显示，1/2Aβ-MCM处理后各时间点均可见荧光强度较高的凋亡神经元细胞核，并伴有染色质的浓缩、聚集。随机选取5个视野，300个细胞计数并进行统计学分析，结果显示，1/2 Aβ-MCM作用6h时，神经元凋亡率最高。　　结论：　　1成功建立了Aβ1-40激活的小胶质细胞条件培养基促大脑皮质神经元损伤模型。　　2 Aβ1-40激活的小胶质细胞产生TNFα和IL-1β，导致大脑皮质神经元caspase-3 mRNA表达上调和神经元凋亡率增加。