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卵母细胞冷冻保存能够充分利用各种来源的卵母细胞,可为体外受精、核移植、转基因等胚胎工程技术的研究和应用实时实地提供大量实验材料。目前,牛卵母细胞的冻存多采用成熟卵母细胞,而有关生发泡(germinal vesical,GV)期卵母细胞尚缺乏系统的研究。本实验研究了牛 GV 期卵母细胞冷冻保存中非渗透性保护剂、预处理时间、冷冻载体及不同大小卵泡卵母细胞对冷冻保存效果的影响。 程序化冷冻牛 GV 期卵母细胞,分别将冷冻保护剂 1.5 M 乙二醇(Ethyleneglycol,EG),1.5 M 丙二醇(1,2-propanediol,PROH)或 0.75 M EG+0.75M PROH加入至 0.1M 蔗糖和 10% FCS 中,结果发现成熟率分别为 10.7%、9.8%、7.9%,相互间差异不显著(P>0.05)。随后,以 1.5 M EG 为渗透性保护剂,分别添加 0(对照组),0.1,0.2,0.3 M 蔗糖,或 10%,20%,30% FCS,结果显示,单独添加各浓度的蔗糖或 FCS 对卵母细胞冻后培养成熟率差异不显著(P>0.05),但同时添加 0.1 M 蔗糖和 10% FCS 时,与未添加组相比,能显著提高卵母细胞冻后培养的成熟率(14.3% vs 5.9%,P<0.05)。 为了检测玻璃化冷冻保护液的毒性作用,将牛GV期卵母细胞分别用FS 30% (聚蔗糖和 0.5 M 蔗糖)、EFS20(FS: EG: FCS=7: 2: 1)处理 5,10,15,20 min,或用 EFS40(FS: EG: FCS=5: 4: 1)分别处理 1,3,5,10 min,用 DPBS 处理20 min 作对照。结果显示,室温条件下,卵母细胞在 FS 液中处理 15 min 以上时,成熟率显著低于对照组(P<0.05);在 EFS20 中处理 10 min 以上时,成熟率极显著低于对照组(P<0.01);在 EFS40 中处理 1 min 时,成熟率即显著低于对照组(43.2% vs 67.4%,P<0.05),处理 3 min 以上时,成熟率极显著降低(P<0.01)。这表明用 FS 短时间处理,不会对卵母细胞产生毒性作用,而 EFS20 和 EFS40的毒性作用随处理时间的增加而迅速增加,即毒性作用随 EG 浓度和处理时间的增加而增加。 分别以玻璃细管和麦管作为冷冻载体,玻璃化冷冻牛 GV 期卵母细胞后的成熟率,玻璃细管二步法 25.0%, 一步法 22.1%; 麦管二步法 11.6%,一步法 8.1%。结果显示,同一载体二步法与一步法之间差异不显著(P>0.05)。 玻璃细管二步平衡法玻璃化冷冻牛 GV 期卵母细胞时,先用 EFS20 分别处理 0.5,1,2,3 min,再用 EFS40 处理 30 s,冻后成熟率分别为 9.3%,10.3%,25.0%和 12.5%。EFS20 处理 2 min 的卵母细胞冻后成熟率要显著高于其他组(P<0.05),其他组之间的差异不显著(P>0.05)。玻璃细管一步法玻璃化冷冻时,用 EFS40 分别处理卵母细胞 1,2,3,5 min,冻后成熟率分别为 0%,16.1%,