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腹泻是一种全球性疾病,在儿童当中发病率和死亡率都较高。肠道具有对电解质离子和水的吸收分泌能力,其分泌和吸收功能的紊乱或吸收和分泌平衡被打破,会导致腹泻。大量研究表明,分泌性腹泻引起的肠道液体大量丢失是由于肠粘膜液体分泌过度和重吸收减少共同作用的结果。腹泻病原毒素引发的氯离子向肠腔内的主动转运及其所驱动的钠离子和水的被动转运是肠道液体过度分泌的主要机制。氯离子向肠腔内的大量分泌是通过激活肠粘膜上皮细胞顶质膜上的氯离子通道实现的,而氯离子转运的电化学驱动力来源于上皮细胞基底膜上钠-钾泵(Na+-K+ATPase)、钠-钾-氯共转运体(NKCC1)和钾通道联合介导的离子转运。分泌性腹泻机制中主要涉及两种类型的氯离子通道:囊性纤维化跨膜电导调节因子(Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)和钙激活氯离子通道(Ca2+-activated chloride channels,CaCCs)。CFTR是一种cAMP依赖的氯离子通道蛋白,CFTR作为肠道上皮细胞跨膜电解质离子转运中心在哺乳动物呼吸道和胃肠道粘膜等多种与分泌和吸收有关组织的上皮细胞广泛表达,为氯离子跨上皮转运提供了选择性通道。在霍乱和旅行者腹泻等由细菌毒素引起的纯分泌性腹泻中,细菌分泌的内毒素主要激活上皮细胞顶质膜上的CFTR氯离子通道。同时霍乱毒素和大肠杆菌内毒素分别通过腺苷环化酶和鸟苷环化酶途径影响CFTR蛋白调节结构域的磷酸化引发通道持续开放和氯离子大量分泌并进而带动Na+和水的转运。在上述过程中细菌内毒素介导的是纯分泌性腹泻,并不引起肠道结构破坏,因此CFTR氯离子通道成为细菌性分泌性腹泻的新分子靶标。钙激活氯通道(Calcium-activated Chloride Channels,CaCCs)在非洲爪蟾卵母细胞中相继发现和证实,直到2008年才报道了跨膜蛋白16A(transmembrane protein16A,TMEM16A)为钙激活氯通道的分子基础,钙激活氯通道能够被细胞内增加的钙离子浓度所激活。目前已发现,在各种分泌上皮如唾液腺上皮和胃肠道细胞等TMEM16A蛋白均有表达。在轮状病毒腹泻,通常认为该病毒的一种非结构蛋白NSP4及其活性降解片段作为病毒分泌的内毒素激活CaCCs氯离子通道。虽然详细的细胞机制尚不清楚,一些证据表明NSP4可能通过直接升高细胞内钙离子浓度,也可能通过肠道神经系统或整合素受体(Integrin receptor)和肝丙素受体(Galanin receptors)间接升高细胞内钙离子浓度从而激活CaCCs氯离子通道。另外,由于上皮细胞内cAMP信号通路与Ca2+介导的信号通路之间存在一定的交扰(Crosstalk),也不能排除CFTR氯离子通道在轮状病毒腹泻中有一定的作用。尼莫地平是生物碱类化合物,具有很多重要的药理价值。尼莫地平属双氢吡啶类钙拮抗剂,主要是通过作用于肌细胞膜L型钙通道阻遏外源钙离子内流降低细胞内钙离子浓度从而达到舒张血管的作用,它可以很容易通过血脑屏障而作用于脑血管及神经细胞,但其确切的作用机制仍然不是很清楚。尼莫地平作为钙离子的拮抗剂在改善脑缺血和脑血管痉挛方面、对癌细胞系的抑制作用方面、在神经系统和记忆方面等都发挥着重要的作用。本研究利用细胞荧光淬灭模型测定了尼莫地平对野生型CFTR(wt-CFTR)Cl-通道的激活活性;同时利用细胞荧光淬灭模型测定了尼莫地平对CaCCs Cl-通道的抑制活性。利用短路电流技术对尼莫地平激起大鼠结肠粘膜CFTR短路电流进行了分析;利用短路电流技术分析了尼莫地平对大鼠结肠粘膜激起的CaCCs短路电流。小鼠肠道闭环实验研究了尼莫地平对小鼠肠道液体分泌的影响。荧光淬灭实验结果显示尼莫地平能够以剂量依赖的方式激活CFTR氯离子通道,其对Cl-的转运活性具有迅速、可逆的特点,这种激活作用能被CFTR特异性抑制剂CFTRinh-172和GlyH101全部抑制,同时尼莫地平对CFTR的激活具有FSK依赖性。CaCCs Cl-通道荧光淬灭实验结果显示尼莫地平能够以剂量依赖的方式抑制由ATP激活的CaCCs Cl-通道,且对CaCCs Cl-通道的抑制具有可逆性。CFTR大鼠粘膜短路电流实验揭示尼莫地平可以激活大鼠结肠浆膜侧CFTR电流,而对黏膜侧短路电流基本没影响。CaCCs大鼠粘膜短路电流实验揭示尼莫地平可以抑制由卡巴胆碱激活的CaCCs短路电流,当提供无钙离子的KH液时尼莫地平对CaCCs基本无抑制作用。小鼠肠道闭环实验结果说明尼莫地平能促进小鼠肠道液体分泌。本实验研究了尼莫地平对CFTR和CaCCs Cl-通道的调节作用,发现了尼莫地平的新活性。同时揭示了尼莫地平作为降高血压药的降压作用可能机制及其用药产生腹泻等副作用的可能原因,为用药提供了一定注意事项。以上结果也提示CFTR和CaCCs作为尼莫地平的分子靶标,尼莫地平可以为研发治疗CFTR和CaCCs的相关疾病的新药奠定了理论基础。