背景与目的近年来抑郁障碍已成为临床上最常见的一个问题。目前对抑郁症的神经生化研究主要有单胺类神经递质假说,神经内分泌功能失调及神经可塑性研究等。根据神经可塑性的研究,有人提出神经源性假说,认为海马新生神经元的产生减少导致抑郁症的发病机制。抗抑郁药治疗后可发现海马神经再生的增加,抗抑郁药可以促进海马神经再生。大量的临床前研究证实应激可以抑制海马神经再生。应激性生活事件是引起抑郁症的重要原因。应激诱导的神经发生减少可能是引起抑郁症的一种重要的影响因子。抗抑郁药治疗可以阻断应激引起的海马神经再生的减少。5-HT神经递质及5-HT类抗抑郁药可以增加海马齿状回神经再生,同时也可以治疗抑郁症。而且,临床抗抑郁药物多数使用1月左右才能够起效,这与海马齿状回神经再生从增殖到分化成熟过程经历的时间相平衡。这可能成熟海马神经再生可能是抗抑郁药疗效的载体,而因此研究海马神经再生对于揭示抑郁症发病的生物学机制具有重要意义。脑内IL-1β是介导抑郁症的重要物质。IL-1β是脑内神经-内分泌-免疫系统中关键的炎性细胞因子,在脑内发挥重要的生理调节功能。目前大量临床和动物实验结果提示脑内炎性细胞因子参与抑郁症的发病过程。脑内IL-1β可引起人和动物的“病态行为”,抗抑郁药物治疗行为性抑郁大鼠,既可减轻抑郁症的症状,又可降低大鼠脑内IL-1β的水平。动物实验,脑室内注射IL-1β可诱导大鼠的行为性抑郁,并且IL-1β受体拮抗剂可部分阻断利血平诱导的大鼠的行为性抑郁。脑内注射IL-1β可降低海马神经再生,IL-1β可能介导了海马的神经再生过程,进一步影响到了抑郁症的发展。本研究拟在利血平诱导的大鼠行为性抑郁模型中探讨脑内IL-1β影响神经元再生过程在抑郁症发病中的作用。探讨炎性细胞因子、神经再生与抑郁症的关系,分析可能的神经生物学机制,为抑郁症的治疗提供新的靶点。行为性抑郁动物模型与检测健康、性成熟清洁级Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,体重200～260g,饲养在26℃、12:12小时光照-黑暗循环的动物房中,自由饮食和饮水。本实验采用4mg/kg的利血平剂量腹腔注射,对照组注射相应的利血平溶剂,建立利血平行为性抑郁模型,通过强迫游泳试验检测大鼠抑郁样行为。实验分组腹腔注射利血平对大鼠海马神经再生影响实验随机分为对照组(Controlgroup,C)和利血平组(Reserpinegroup,R)。在IL-1Ra对大鼠海马神经前体细胞增殖影响的实验中,随机分为对照组(Controlgroup,C)和利血平组(Reserpinegroup,R),其中每组的一半大鼠脑内注射IL-1Ra或PBS。具体分组为:对照组(Controlgroup,C),利血平组(Reserpinegroup,R),对照+L-1Ra组(C+L-1Ra),利血平+IL-1Ra组(R+IL-1Ra)。侧脑室插管与注射在对侧脑室插管注射IL-1Ra对大鼠海马神经前体细胞增殖影响的实验研究中实验大鼠先进行侧脑室导管安装实验。通过单臂大鼠脑立体定位仪,定位大鼠右侧侧脑室(前囟后0.9mm,旁1.5mm,颅骨下深3.8mm),插入大鼠脑室微量注射系统套管。固定放置1周后进行药物注射。其中0.01MPBS和0.25ug/ulIL-1Ra通过微量注射泵经侧脑室插管注射,4mg/kg利血平和相应剂量的乙酸随后进行腹腔注射。海马神经再生的检测在利血平注射40h后各组均开始腹腔注射Brdu,75mg/kg,4次/2h,标记海马神经再生过程。药物注射后均以生理盐水和4%多聚甲醛灌注后,制作冰冻切片,检测大鼠海马神经再生过程包括神经前体细胞的增殖、分化和新生神经元改变等。侧脑室插管大鼠需要制作大鼠侧脑室插管部位切片,检验插管定位的准确性。利血平注射后48h的大鼠组织用于检测海马齿状回神经前体细胞增殖;利血平注射后72h的大鼠组织用于检测海马齿状回神经前体细胞分化及新生未成熟神经元;利血平注射后4周的大鼠组织用于检测海马齿状回新生成熟神经元的存活。数据分析与统计采用Image-ProPlus6.0(IPP)软件分析免疫组化图片。实验数据应用Excel2003和SPSS13.0统计软件进行统计分析,统计结果以均数±标准差(x±SD)表示,数据间采用独立样本t材料与方法检验或方差分析。以P≤0.05为差异具有显著性，P≤0.01为差异具有高度显著性。结果第一部分利血平诱导的行为性抑郁和海马神经再生改变1、腹腔注射利血平诱导大鼠行为性抑郁利血平组腹腔注射利血平4mg/kg，对照组腹腔注射2%乙酸溶剂，0、24、48和72小时进行15分钟游泳试验，测定大鼠的漂浮时间，作为行为性抑郁的指标。结果表明，对照组与利血平组大鼠游泳试验24h（7.0±0.5和13.4±0.9），48h（7.2±0.6和12.9±0.7），72h（8.0±0.8和12.6±0.9）漂浮时间相比差异具有显著性（ANONA,P<0.01）。与对照组相比利血平组大鼠在利血平腹腔注射后的24～72小时，大鼠的漂浮时间显著延长，作用高峰在24～48小时。结果表明，腹腔注射4mg/kg的利血平后24-72小时的大鼠具有行为性抑郁样表现。2、利血平诱导的行为性抑郁大鼠海马神经再生的改变目前发现终生可以神经再生的部位：嗅觉系统的SVZ区和海马结构齿状回SGZ区。成熟脑海马齿状回的SGZ区存在多功能的前体细胞。前体细胞可以增殖、迁移分化、成熟生产新生的神经元、星型胶质细胞或少突胶质细胞等，整个过程成为神经再生。大鼠海马齿状回神经再生周期约为4周，其中神经前体细胞被Brdu标记后增殖持续12-14h。在增殖后的2h开始逐渐向海马齿状回颗粒细胞层迁移。增殖后的神经前体细胞在第2-7天内进行分化，其中分化的新生神经元在1月左右成熟，表达成熟神经元的标记物NeuN等。利血平组(Reserpine group，R)腹腔注射利血平（4mg/kg），对照组（Control group,C）注射相应剂量的乙酸溶剂。大鼠腹腔注射利血平后40小时，两组开始腹腔注射Brdu（75mg/kg），每2小时1次，注射4次。对应海马神经再生的时间过程，分别在注射利血平48h、72h和4周心脏灌注取脑，分别检测脑内海马齿状回神经前体细胞增殖、分化和新生神经元改变情况。2.1利血平诱导的行为性抑郁大鼠海马神经前体细胞增殖的改变用Brdu标记大鼠海马神经再生过程，同时通过内源性增殖标记物Ki67检测海马神经前体细胞增殖。观察腹腔注射利血平对海马神经前体细胞增殖的影响。Brdu和Ki67阳性细胞在脑部结构中主要集中在海马齿状回SGZ区。其中单位齿状回面积的Brdu阳性细胞在对照组和利血平组的数目分别为10.86±1.40、5.18±1.16。单位齿状回面积的Ki67阳性细胞在对照组和利血平组的数目分别为22.4±9.88、11.38±6.71。与对照组相比，利血平组单位海马齿状回面积的Brdu阳性细胞数（t=2.162,P<0.01）和Ki67阳性细胞数(t=2.695,P<0.05)明显减少，差异具有显著性。结果显示，利血平诱导的行为性抑郁大鼠的海马神经前体细胞增殖受到抑制。2.2利血平诱导的行为性抑郁大鼠海马神经前体细胞分化的改变腹腔注射利血平后48h心脏灌注，组织冰冻切片用Brdu免疫组织化学方法检测脑内海马齿状回SGZ区神经前体细胞分化。Brdu阳性细胞主要集中在海马齿状回SGZ区。两组大鼠单位海马齿状回面积的Brdu阳性细胞数经Lg10数据转换后，进行K-S检验后符合正态分布。两组单位海马齿状回Brdu阳性细胞数量分别为3.70±3,71和0.42±0.73。与对照组相比，利血平组大鼠海马齿状回SGZ区单位海马齿状回面积的Brdu阳性细胞数量明显减少，差异具有显著性（P<0.05）。结果表明利血平行为性抑郁大鼠的海马神经前体细胞分化过程受到抑制。2.3利血平诱导的行为性抑郁大鼠海马新生神经元的改变在海马神经再生过程第2-10天，神经前体细胞逐渐向神经元分化，开始表达doublecortin（DCX），可作为新生未成熟神经元标记物。在7-10天开始表达成熟神经元具有的NeuN等，1月后70%新生神经元表达成熟神经元标记物。2.3.1利血平诱导的行为性抑郁大鼠海马新生未成熟神经元的改变利血平腹腔注射后72h心脏灌注两组大鼠，用免疫组织化学方法检测脑内海马齿状回DCX（双皮质激素）的表达，DCX表达于新生未成熟神经元，用于检测新生未成熟神经元。与对照组相比，利血平组大鼠海马齿状回DCX阳性细胞数量、树突长度和树突数量差异均无显著性。结果表明利血平在72h的短期内对海马齿状回新生未成熟神经元没有直接影响。2.3.2利血平诱导的行为性抑郁大鼠海马新生成熟神经元存活的改变腹腔注射利血平后4周两组大鼠，心脏灌注后制作冰冻切片，Brdu免疫组织化学及Brdu和NeuN免疫荧光双标法检测海马齿状回新生神经元的存活。两组大鼠单位海马齿状回面积的Brdu和NeuN双标细胞数经Lg10数据转换后，进行K-S检验后符合正态分布。对照组和利血平组Brdu和NeuN双标细胞数分别为3.80±2.83和0.82±0.99。与对照组相比，利血平组大鼠单位海马齿状回面积的Brdu和NeuN双标细胞数明显减少，差异具有显著性（P<0.05）。结果表明利血平行为性抑郁大鼠的海马新生神经元的存活受到抑制。第二部分脑内IL-1β对利血平诱导的行为性抑郁和海马再生的影响1、腹腔注射利血平诱导大鼠行为性抑郁利血平组大鼠脑室注射IL-1Ra，对照组大鼠脑室注射等体积0.01M PBS，同时腹腔注射利血平（4mg/kg）或相应剂量的乙酸溶剂后，分别在注射后的1、24和48h测定游泳试验。结果显示，在利血平注射后的1h和24h，脑室注射IL-1Ra对利血平引起的漂浮时间的延长没有影响；在利血平注射后48h，R与R+IL-1Ra两组间的平均漂浮时间为12.87±0.78和8.68±0.76。脑室注射IL-1Ra可反转利血平引起的漂浮时间的延长（ANOVA，P<0.01；组间差异比较用SNK法）；单纯脑室注射IL-1Ra对正常大鼠的游泳试验没有影响。2、脑内注射IL-1Ra对利血平诱导的行为性抑郁大鼠海马神经前体细胞增殖的影响免疫组织化学方法检测脑内海马齿状回SGZ区神经前体细胞增殖。在大鼠海马结构中，Brdu阳性细胞主要集中在齿状回SGZ区。C、R、C+IL-1Ra和R+IL-1Ra 4组大鼠单位海马齿状回面积的Brdu阳性细胞数分别为5.07±5.66、3.30±2.31、0.97±0.86、6.06±5.13，经平方根数据转换后，进行K-S检验后符合正态分布。结果显示，正常大鼠脑室注射IL-1Ra对单位海马齿状回面积的Brdu阳性细胞数量没有影响（P>0.05, C vs C+IL-1Ra）。腹腔注射利血平可导致海马齿状回SGZ区单位面积的Brdu阳性细胞减少，差异有显著性（P<0.05，R vs C）；脑室注射IL-1Ra可明显提高利血平注射大鼠单位海马齿状回面积的Brdu阳性细胞数量，差异有显著性（P<0.01，R vs R+IL-1Ra）。结果提示，脑室利血平可导致大鼠的海马神经前体细胞增殖受到抑制，而脑内注射IL-1Ra可以逆转利血平诱导的海马神经前体增殖的抑制。结论腹腔注射利血平可以诱导大鼠行为性抑郁，同时海马神经再生过程受到抑制，而IL-1受体拮抗剂可以逆转行为性抑郁及被抑制的神经前体细胞增殖。因此可以推断，脑内IL-1β是利血平诱导大鼠行为性抑郁的原因之一，而海马神经再生的障碍可能是IL-1β的作用机制之一。炎性因子与海马神经再生可能参与了抑郁障碍的神经生物学机制。