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目的:感染疟原虫的红细胞会特异性表达生成新渗透性通道(NPPs),并在红细胞膜上过表达胆碱转运载体(ECCs)。基于此,本课题以胆碱-聚乙二醇衍生物(CD-PEG-SA)为修饰分子,构建粒径<80 nm的胆碱-聚乙二醇双修饰蒿甲醚脂质纳米粒(CD-PEG-ARM-NLC),以期靶向红细胞膜上的NPP通道和ECC载体,达到长循环和靶向抗疟的作用。制备并表征CD-PEG-ARM-NLC;考察其对约氏疟原虫(Py BY265)、恶性疟原虫(Pf3D7)的体内外抗疟活性;并通过包载荧光探针香豆素-6研究CD-PEG-NLC对感染红细胞的靶向性。方法:1.CD-PEG-ARM-NLC的处方工艺考察在前期工艺研究基础上,采用高压乳匀法制备CD-PEG-ARM-NLC,通过对CD-PEG-SA的加入方式、用量进行单因素考察,优化制备处方。2.CD-PEG-ARM-NLC的质量表征对CD-PEG-ARM-NLC的形状、粒径、Zeta电位、包封率、载药量等理化性质进行表征,考察药物的体外释放特性,并进行体外溶血试验。3.CD-PEG-ARM-NLC的体外抗疟活性评价通过明胶沉降法从常规培养的Pf3D7中分离得到有/无knob结构的Pf3D7,以ARM为阳性对照,采用常规培养的、有/无knob结构的Pf3D7,应用SYBR Green I法,考察不同浓度的ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC对疟原虫增殖的抑制作用,以药物的半数抑制浓度(IC50)为指标考察其体外抗疟活性。4.CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察以香豆素-6(C6)为荧光探针,C6溶液为阳性对照,高压乳匀法制备C6-NLC、PEG-C6-NLC、CD-PEG-C6-NLC。将荧光纳米粒分别与体外培养的Pf3D7感染的红细胞、在体Py BY265感染的疟鼠红细胞孵育,荧光显微镜下观察荧光分布和强度。通过NPP通道和ECC载体抑制试验,比较不同纳米粒组的荧光亮度,分析NPP通道和ECC载体对纳米粒进入感染红细胞的影响。5.CD-PEG-ARM-NLC的体内药效学研究采用约氏疟原虫BY265感染小鼠模型,以溶剂组、三种空白纳米粒组,不治疗(空白)组为阴性对照,以ARM组为阳性对照,通过四天抑制试验和28天治愈试验考察ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC三种纳米粒的抗疟活性。结果:1.CD-PEG-ARM-NLC考察后处方CD-PEG-SA的加入方式为外加乙醇法,加入量为m胆碱/m混脂=19.24%(g/g)。考察后的处方组成为:GMS 1.9286 g,MCT 1.0714 g,RH40 1.2 g,ARM 0.768 g,CD-PEG-SA 0.5772 g,去离子水100 ml。2.CD-PEG-ARM-NLC的质量表征CD-PEG-ARM-NLC是均一、略带蓝色乳光的半透明液体制剂,透射电镜结果显示纳米粒呈类球形,粒径分布均匀;测定平均粒径为65.10±0.64 nm,多分散系数为0.186±0.004;Zeta电位为-24.47±1.01 m V;包封率为87.03%±0.71%;载药量为11.62%±0.10%;在p H 7.4的磷酸盐缓冲液中72 h内体外累积释放率为81.95%±0.85%,释药规律符合Weibull方程,t50为10.36 h;体外溶血试验无红细胞聚集及溶血现象。3.CD-PEG-ARM-NLC的体外抗疟活性评价SYBR Green I法测得ARM、ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC对常规培养的Pf3D7的IC50值分别为4.28±0.05、3.69±0.07、3.22±0.05、2.68±0.05nmol/L;对有knob结构的Pf3D7的IC50值分别为4.32±0.06、3.93±0.03、3.58±0.08、3.01±0.05 nmol/L;对无knob结构的Pf3D7的IC50值分别为4.27±0.06、3.34±0.07、2.81±0.08、2.12±0.09 nmol/L。4.CD-PEG-C6-NLC靶向性的初步考察荧光显微镜观察结果显示,纳米粒基本不进入正常红细胞,但可进入感染红细胞,且能聚集于疟原虫周围,而不是弥散于整个红细胞;CD-PEG-C6-NLC组的荧光强度高于C6-NLC组和PEG-C6-NLC组;以上结果显示CD-PEG-C6-NLC对感染红细胞有靶向作用。加入NPP抑制剂(呋塞米)可基本阻断C6-NLC和PEG-C6-NLC进入感染红细胞,但CD-PEG-C6-NLC仍可进入感染红细胞;同时加入NPP抑制剂(呋塞米)和ECC天然底物(胆碱)方能基本阻断红细胞对CD-PEG-C6-NLC的摄取。5.CD-PEG-ARM-NLC的体内药效学研究阳性对照组ARM尾静脉注射的ED50值为0.266 mg/(kg·day),ED90值为0.945mg/(kg·day),ARM-NLC、PEG-ARM-NLC、CD-PEG-ARM-NLC的ED50值分别为0.245、0.233、0.228 mg/(kg·day),ED90值分别为0.927、0.905、0.872 mg/(kg·day),表明ARM制成纳米粒后抗疟活性有一定的提高。结论:采用优化后处方制备CD-PEG-ARM-NLC,其粒径、Zeta电位、包封率、载药量、体外释放特性和溶血试验等指标均符合预期要求;体内外药效实验均说明CD-PEG-ARM-NLC比ARM、ARM-NLC和PEG-ARM-NLC有更好的抗疟活性;靶向试验初步结果表明CD-PEG-C6-NLC对感染红细胞有靶向作用,更深入的验证有待后续实验。