研究背景瘢痕形成是创面修复过程中难以避免也十分棘手的问题,深度烧伤等严重皮肤损伤后均会有不同程度的瘢痕形成,这严重影响了伤处的外观及后期功能活动。增生性瘢痕的防治是临床研究的重要方向,但直到现在,增生性瘢痕的发生发展机制仍不十分清楚,导致其治疗效果十分有限。研究发现,成纤维细胞是参与创面修复的主要功能细胞之一,它通过分泌过多的细胞外基质(extracellμLar cell matrix,ECM)和过度增殖而在增生性瘢痕发生发展中起着重要作用。TGF-β1是组织纤维化过程中十分关键的因子,大量研究表明TGF-β1及其下游靶分子通过影响细胞增殖、凋亡、分化、自噬和局部免疫反应来影响组织纤维化。在组织修复的早期,增生性瘢痕组织会高表达TGF-β1从而促进真皮成纤维细胞的增殖及迁移,这与瘢痕的产生密切相关。我们课题组前期研究发现,在皮肤真皮成纤维细胞中TGF-β1可以促进P311基因的表达,而P311在组织纤维化、成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化中均发挥重要的作用,除此以外,P311还参与神经再生、肿瘤侵袭、血压稳态维持、血管再生、肺泡发生等重要病理生理学过程。但纤维化过程中P311上游调控机制尚不清楚。创面的修复过程主要包括三个步骤,炎症、增生和重塑。血小板脱颗粒负责释放和激活一系列有效的细胞因子,包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)这些细胞因子作为趋化剂招募巨噬细胞、中性粒细胞、上皮细胞和成纤维细胞。在正常伤口中,细胞凋亡和细胞外基质(ECM)重塑介导的新组织生物合成和降解达到平衡。在过度瘢痕形成过程中,潜在调节机制的功能障碍可能导致持续炎症、过度胶原合成或基质降解和重塑不足。TGF-β1在这些调节机制中均发挥了重要的作用。因此,深入了解TGF-β1对成纤维细胞转录表达的影响能够帮助我们进一步明确TGF-β1在纤维化过程中的机制。同时,也为我们研究TGF-β1是如何调控P311表达也能提供一定的线索。第一部分P311基因启动子区的预测和鉴定方法:1.生物信息学预测P311基因启动子位置利用人类细胞表观遗传学数据库Roadmap分析P311基因潜在启动子不同区域上的表观遗传学修饰水平,包括H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3和DNase。2.P311启动子截短质粒的构建用PCR扩增启动子片段,琼脂糖凝胶鉴定片段大小,通过双酶切方式连接p GL3-Basic载体和目的片段,再利用菌液PCR和测序鉴定质粒合成情况;3.启动子活性的检测和活性启动子区的鉴定使用Lip2000将目的质粒转染入293T细胞,并利用双荧光素酶报告系统检测不同片段大小启动子(promoter-1系列和promoter-2系列)的活性;结果:1.生物信息学预测P311基因启动子位置我们选出两段潜在的启动子序列,分别命名为promoter-1(chr5:111092954-111094954)和promoter-2(chr5:111333162-111335162)(hg38作为参考基因组)。通过Roadmap数据库的分析序列的表观遗传学修饰水平,结果显示promoter-1序列上的H3K4me3以及DNase的富集水平较promoter-2的程度高。2.P311启动子截短质粒的构建成功构建搭载有2kb、1.5kb、1kb和0.6kb大小的promoter-1系列p GL3-Basic质粒;成功构建2kb、1.5kb、1kb、0.8kb、0.6kb、0.4kb和0.2kb大小的promoter-2系列pGL3-Basic质粒。3.启动子活性的检测和活性启动子区的鉴定双荧光素酶报告系统对不同片段大小的质粒进行鉴定,发现promoter-2具有启动子活性,pro-0.4中0.4kb大小的序列是P311基因的核心启动子。第二部分TGF-β1对P311基因的转录调控及机制研究方法:1.TGF-β1刺激对成纤维细胞转录组表达的影响通过Illumina测序检测TGF-β1刺激后成纤维细胞中转录本的表达情况及差异;再利用GO和KEGG分析差异基因,找出富集的信号通路和生物学功能;2.TGF-β1对P311转录水平的影响通过实时荧光定量PCR检测TGF-β1刺激前后P311基因mRNA表达水平的差异;3.Meox1对P311的转录调控作用利用JASPAR预测能与P311核心启动子区结合的潜在转录因子,构建Meox1真核过表达质粒和特异性干扰RNA,转染细胞后,利用实时荧光定量PCR检测Meox1过表达组、Meox1干扰组和对照组中P311 m RNA表达水平;构建Meox1结合位点缺失的pro-0.4质粒,利用双荧光素酶报告系统检测缺失组和对照组启动子活性的差异;TGF-β1刺激细胞,利用染色质免疫共沉淀-荧光定量PCR检测刺激组和对照组中Meox1蛋白在P311启动子区的富集度。4.Meox1在人增生性瘢痕中的表达情况2018年1月—2019年6月,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院收治3例烧伤后8～12个月增生性瘢痕患者(男2例、女1例,年龄35～56岁),取其瘢痕组织和瘢痕边缘附带正常皮肤组织,行免疫组织化学染色,观察Meox1蛋白表达分布。结果:1.TGF-β1刺激对成纤维细胞转录组表达的影响GO分析显示,TGF-β1对皮肤成纤维细胞的影响主要涉及组织修复,细胞的迁移及炎性细胞的趋化诱导等过程;KEGG通路分析显示,TGF-β1在皮肤成纤维细胞中发挥作用可能是通过TNF、IL-17或者细胞外基质受体等潜在的信号通路。TGF-β1刺激的成纤维细胞代谢水平和转录水平较对照组高。2.TGF-β1对P311转录水平的影响在HDF-a细胞中,TGF-β1可以显著促进P311m RNA的表达水平;3.Meox1对P311的转录调控作用JASPAR我们利用JASPAR数据库预测出能够结合到pro-2-4的所用潜在转录因子,包括ZNF384,TFAP2C,Meox1,MZF1和YY1等;Meox1过表达可以上调P311 m RNA的表达水平,敲低Meox1表达后,P311m RNA的表达水平显著降低;Meox1在P311启动子区的结合位点缺失后,会显著抑制P311启动子活性;TGF-β1刺激可以增加Meox1在P311启动子区的富集度。4.Meox1在人增生性瘢痕中的表达情况增生性瘢痕患者瘢痕组织中Meox1蛋白表达明显高于正常皮肤组织。第三部分TGF-β1调控Meox1的机制研究和Meox1对成纤维细胞生物学功能的影响方法:1.TGF-β1刺激对Smad2/3/4在Meox1启动子区富集的影响通过Ch IP-q PCR分别检测TGF-β1刺激组和刺激组中Smad2、Smad3、Smad4蛋白在Meox1启动子区的富集度2.Smad2/3干扰和过表达对Meox1启动子活性的影响首先,我们构建了Smad2/3/4真核过表达质粒和合成Smad2/3/4特异性干扰RNA,接着通过Lip2000转染质粒或干扰RNA进入HDF-a细胞后,再利用RT-q PCR检测Meox1的mRNA表达水平;同时,利用ChIP-qPCR检测Smad2/3/4过表达和敲低之后,其蛋白在Meox1启动子区富集度的变化;3.Meox1对成人真皮成纤维细胞迁移和增殖功能的影响利用划痕实验和Transwell实验,分别检测Meox1敲低或过表达对HDF-a细胞迁移能力的影响;利用CCK8细胞毒性实验,分别检测Meox1敲低或过表达对HDF-a细胞增殖能力的影响结果:1.TGF-β1刺激增强Smad2/3/4在Meox1启动子区的富集TGF-β1刺激可以上调Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子区的富集度;2.Smad2/3干扰和过表达对Meox1启动子活性的影响Smad2、Smad3和Smad4蛋白过表达之后可以显著上调Meox1 mRNA的转录水平;Smad2、Smad3和Smad4蛋白过表达后,Smad2和Smad3在Meox1的富集度高于对照组,而Smad4与对照组无明显差异;干扰或过表达Smad2、Smad3、Smad4之后,观察到Smad2和Smad3在Meox1基因启动子区的富集程度均有显著变化,然而Smad4的变化不显著。3.Meox1对成人真皮成纤维细胞迁移和增殖能力的影响划痕实验表明,Meox1过表达组中,细胞愈合宽度大于对照组,Meox1敲低组中细胞愈合宽度小于对照组;Transwell实验表明,Meox1过表达组的迁移细胞数目显著多于对照组,而Meox1敲低组的迁移细胞数目显著少于对照组。结论:本研究通过构建截短质粒和双荧光素酶系统实验,首次鉴定出P311基因的启动子位于chr5:111999065-111999465(hg38作为参考基因组)。并通过转录组测序、启动子序列的转录因子预测分析和染色质免疫共沉淀实验,证实TGF-β1作用于人真皮成纤维细胞后通过调控同源盒基因1(Meox1)进而转录调控P311基因的表达,进而影响其迁移。本文还通过RNA干扰和过表达实验,证实TGF-β1主要是通过影响转录因子Smad2和Smad3在Meox1基因启动子区域的富集从而调控Meox1基因转录水平。综上所述,本研究发现了TGF-β1通过影响Smad2和Smad3在Meox1基因启动子区的富集进而转录调控Meox1的表达,进而影响P311基因启动子活性和转录水平,从而影响成纤维细胞迁移和增殖的能力。