国产重组抗CD20单抗与国外已上市同类药Rituximab比较,是否具有相似或更好的与肿瘤细胞表面CD20分子的结合力、体内外药效作用以及相似的动物体内药代动力学特征。按照新生物制品有效性研究的要求,提供国产重组抗CD20单抗体内外药效学及临床前药代动力学研究资料。本研究分为两个部分:第一部分:国产重组抗CD20单抗抗肿瘤作用的药效学研究1、选用两种CD20高表达的肿瘤细胞（Raji细胞、Daudi细胞）和CD20阴性细胞（MX-1细胞）,用乳酸脱氢酶（LDH）法细胞杀伤试验试剂盒检测重组抗CD20单克隆抗体体外对肿瘤细胞的补体依赖的细胞毒作用（CDC作用）,并与对照品Rituximab比较,评价国产重组抗CD20单抗的体外CDC作用。国产药rh-anti-CD20ximAb对CD20阳性的Raji和Daudi细胞的体外CDC效应非常明显,而且与对照品Rituximab的溶解细胞的CDC效应非常相似:对Raji细胞的3次重复平均半数有效抑制浓度(IC₅₀)分别为740±76 ng/mL和809±39 ng/mL,平均EC₅₀比值为91.31±5.27 %。对Daudi细胞的3次重复平均半数有效抑制浓度(IC₅₀)分别为729±57 ng/mL和846±145 ng/mL,平均EC₅₀比值为87.42±7.88%。2、选用两种CD20高表达的肿瘤细胞（Raji细胞、Daudi细胞）和CD20阴性细胞（MX-1细胞）作为靶细胞,用人外周血单核细胞（PBMC）作为效应细胞,在不同的效:靶比条件下,用乳酸脱氢酶（LDH）法细胞杀伤试验试剂盒检测重组抗CD20单克隆抗体体外对肿瘤细胞的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC作用）,并与对照品Rituximab比较,评价国产重组抗CD20单抗的体外ADCC作用。国产药rh-anti-CD20ximAb对CD20阳性的Raji、Daudi细胞的体外ADCC效应非常明显,而且与对照品Rituximab溶解细胞的ADCC作用非常相近。对于Raji、Daudi细胞,在效:靶比分别为100:1、40:1、16:1、6:1情况下,国产药与对照药都随着效:靶比的降低,其对Raji和Daudi细胞的杀伤率也随之降低,但二者在相同效:靶比下,对Raji和Daudi细胞的杀伤率接近。而对于CD20阴性细胞MX-1,二者对MX-1细胞的杀伤率都在10%以下。3、国产重组抗CD20单抗体外与CD20高表达人B细胞淋巴瘤细胞系Raji细胞的高亲和力结合,此实验包括饱和结合试验和竞争性抑制试验。饱和结合结论说明国产rh-anti-CD20ximAb可以与CD20高表达B-淋巴细胞瘤Raji细胞高亲和,可逆性,低容量地结合。竞争性抑制实验结论说明国产rh-anti-CD20ximAb和对照品Rituximab对高表达CD20抗原人B细胞淋巴瘤Raji细胞与125I-rh-anti-CD20ximAb结合的抑制作用相似,二者的IC₅₀值分别为3.13±0.38μg/mL和3.45±0.59μg/mL,两者非常接近。4、猕猴静脉滴注重组抗CD20单抗和对照品后,观察猕猴外周血中的B淋巴细胞水平,三个剂量组之间比较及与对照品比较,观察国产药在猕猴体内是否达到了与对照品相似的CDC作用和ADCC作用。流式细胞仪检查表明猕猴药前C20阳性的B淋巴细胞量都在14.37-47.91%之间,各组间比较无统计差别。相同剂量的受试品和对照品(30 mg·kg^-1?1),注射后2h-20d内,二者在统计学上均无明显差别（P>0.05）。第二部分:国产重组抗CD20单抗的临床前药物代谢动力学研究。1、建立了双抗夹心ELISA法检测猴血清中的重组抗CD20单抗的浓度。经过方法学确证,该方法的标准曲线、特异性、板内和板间精密度、准确度、LLOQ、回收率、稳定性及样品稀释倍数的影响均满足重组抗CD20单克隆抗体的药代动力学研究的要求。2、研究单次低、中、高(10、30和100 mg·kg^-1)三个剂量组滴注给药后和中剂量(30 mg·kg^-1)连续4次静脉滴注给药后,国产重组抗CD20单抗在猕猴体内的药物代谢动力学情况,并比较中剂量给药后与同剂量的对照品Rituximab给药后的药动学特征。猕猴单次静脉滴注10,30和100 mg·kg^-1国产rh-anti-CD20ximab后,多数猕猴在给药后0.5h血清药物浓度达到最高,血清药物浓度随着滴注剂量的增高而增高,末端相半衰期随着剂量的增加无显著延长,低、中、高剂量组在给药后480h血清药物浓度下降到峰浓度的1/10～1/20。对各组药代动力学参数比较,平均驻留时间随着剂量的增加并没有延长。剂量之比为1:3:10,AUC的增长为1:3.0:9.2,与剂量成正比例增加。全身清除率CLS随剂量增加并没有显著变化,具有线性动力学特征。猕猴间隔7天静脉滴注国产rh-anti-CD20ximab,连续4次给药后,第4次给药后的血清药物浓度和药物代谢动力学参数跟首次比较,有统计学意义上的差别（P<0.01）,三只猴第4次给药后和首次给药后给药间期的AUC_0-ι比值(AUC_{0-ι（第4次）}/AUC（0-ι（第1次））)分别为1.72、1.87和1.84;平均为1.81±0.08,表明国产rh-anti-CD20ximab在30mg·kg^-1剂量下间隔7天连续给药4次后在猕猴体内可能有药物蓄积作用。猕猴静脉滴注对照品Rituximab和受试品国产rh-anti-CD20ximab实验结果显示,各只猴中对照品Rituximab和受试品制品国产rh-anti-CD20ximab的药-时曲线,就总体而言,图形较为吻合,且数值相近。3只猕猴对照品和受试品浓度的Student`s配对t-检验,在给药后所有时间点受试品与对照品平均浓度均无统计学意义差别（P>0.05）。而药代动力学结果提示,二者所有的药物代谢动力学参数AUC_0-480h、MRT、CL_S、V_SS、C_max均无统计学意义（P>0.05）,表明国产rh-anti-CD20ximab与罗氏公司的Rituximab药物代谢动力学行为相近。