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自高效抗逆转录病毒治疗(HAART)广泛应用于临床以来,抗病毒治疗能显著增强HIV-1感染患者的生存期,但是仍未能彻底清除感染。治疗患者体内,HIV-1在静息T细胞等中呈持续性的转录非活跃状态,并在T细胞活化后重新激活。这种潜伏状态使得病毒即使处于HARRT治疗下也长期存在,无法根治。潜伏通常描述成一种病毒可逆的非生产性感染状态,通常无子代毒粒释放。研究发现,HIV-1入侵宿主细胞后急性感染期即开始建立潜伏库。实际的潜伏状态也可以出现基线转录下少量的HIV-1转录、不完整性合成等诸多情况。相对于总体的受染细胞,HIV-1突破宿主防御建立潜伏的频率稀少。但其赋予HIV-1逃逸免疫监视、HAART攻击、可随细胞遗传并重新激活的持续性感染特征,是目前抗病毒清除策略的最大障碍。对于HIV-1潜伏相关细胞分子的系统挖掘,是进一步揭示潜伏机制的前提,也是为今后根治提供科学依据,具有很大的应用价值。国外系列研究已显示微小RNA (miRNA)调节HIV-1的生活周期,但尚无对HIV-1潜伏的miRNA组学报道。本论文以体外HIV-1潜伏感染细胞株为潜伏模型,以HIV-1持续复制细胞及空白细胞为对照,经生物芯片技术进行]miRNA与mRNA的表达谱研究与鉴定。HIV-1潜伏细胞株相比于复制株具不同的miRNA及mRNA转录模式。潜伏感染中差异表达的miRNA不仅有诸如miR-223等已有报道的HIV-1感染相关miRNA,亦发现此前未经报道的miR-363等分子。经基因本体语义(GO)分析,我们发现RNA代谢、核运输相关基因、转录调控是HIV-1潜伏细胞的功能关键,而在HIV-1复制中更多的与细胞周期、凋亡等有关。靶分子通路分析显示潜伏感染中的细胞外基质通路富集,这是潜伏信号源于胞外信息启动的一条重要的线索。miRNA、转录因子等均是基因表达的重要调节子,通过大量的数据分析及汇集,我们进一步建立融合miRNA、mRNA(包括转录因子)的调控网络,通过潜伏与复制状态间的最显著变化挖掘重要的基因调控节点。我们发现miR-223、miR-363等miRNA与调节HIV-1感染相关,转录调节与细胞分化、胞外信号等是潜伏向复制状态变迁的最大特征之一临床长期不进展(LTNP)患者表现出自发性抑制病毒及低残余病毒血症特征。这种表型与HIV-1潜伏类似。同时,受迄今HIV-1潜伏细胞无生物标记可循、无体内模型所限,以LTNP为背景与HIV-1体外模型比较,我们期待发掘更特异性的分子分歧。在高通量芯片数据库内发掘所有的HIV-1潜伏(25例)及LTNP(22例)表达谱,并整合所有表达谱数据经主方差成分分析与启发式聚类评估。结果发现潜伏与LTNP出现456条差异基因。以贝叶斯推断法建立各感染状态下差异基因的调控网络,研究显示不同感染状态下,基因调节网络出现重构。通过中心参数为特征的结构分析,我们亦证明HIV-1感染相关基因的高连接特征。以之为基础鉴定出,HIV-1潜伏中KPNA2与ATP5G3是关键基因,介导RNA代谢与核运输。我们进一步在体外细胞中验证KPNA2、ATP5G3的差异表达及在潜伏细胞中的高表达特性。HIV-1的潜伏具体发生于细胞核内染色质微环境中,其前提是HIV-1启动子的转录沉默。陆续有潜伏机制的提出,均围绕于转录受抑而展开,诸如不同的转录因子、转录干扰、相关的表观修饰等机制。前述结果也已说明RNA代谢、转录调节是HIV-1潜伏的重要特征。为探查相关分子对HIV-1的转录调控,我们建立起HIV-1启动子的报告系统。以重组PCR技术快速建立HIV-1启动子的各种截短突变体,应用于宿主分子的响应元件定位。RbBP4分子是多个染色质相关蛋白复合体的成员,是一贯穿染色质代谢全过程的协转录分子。过表达与敲低后的荧光素酶报告实验发现,RbBP4分子在在HIV-1Tat依赖方式的转录中起下调作用。综上所述,HIV-1潜伏的机制是多重因素的复合影响。通过高通量的筛选,我们鉴定出一系列的候选分子(包括miRNA、mRNA)及其联系。同时,为贴近体内环境,采用与HIV-1潜伏最为接近的临床LTNP患者作为对照,将HIV-1潜伏的功能关键点逐步缩小于转录调节等范围；这一层次仍将作为今后挖掘潜伏机制的切入点。建立起HIV-1转录调控筛选报告模型,可用于今后一系列宿主分子的筛选。发表相关SCI论文4篇。本研究得出以下结论：1、首次在HIV-1体外潜伏细胞中绘制miRNA表达谱,合并mRNA表达谱,发现HIV-1潜伏与复制具不同的转录模式。建立自主的miRNA-mRNA联锁分析方法,发现HIV-1潜伏与复制变迁的重要调节点。验证出miR-223、miR-363等是潜伏相关的miRNA。2、进行细胞水平HIV-1潜伏与体内LTNP样本的比较。通过基因调节网络,发现不同感染状态下的调控重构。KPNA2与ATP5G3等是HIV-1潜伏网络的关键基因。3、建立快速突变技术,构建HIV-1启动子转录调控筛查与定位系统。RbBP4的筛查显示双相特征,提示细胞染色质微环境的依赖性。HIV-1的潜伏是当前HARRT治疗的盲点。本研究构建HIV-1感染的基底数据,以系统生物学方式挖掘潜伏为主要导向的关键基因及其调控。通过转录活性的筛选,为进一步的HIV-1潜伏机制研究及抗潜伏设计打下基础。