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雷公藤(Ttipterygium wilfordii Hook.f.)为木质藤本植物,系卫矛科雷公藤属,具有良好的农用活性和医药价值。由于雷公藤能产生一系列有生物活性的物质,包括雷公藤甲素、雷公藤生物碱等,近二十年来国内外对雷公藤进行广泛的研究。在医用资源的竞争和雷公藤植物本身繁殖速度缓慢的两重压力下,雷公藤生物碱杀虫剂的资源问题显得更加突出。雷公藤的需求量越来越大,大量的雷公藤野生资源被破坏,寻找到能大量产生雷公藤次生代谢产物的材料就成为了当务之急。本研究从分离自雷公藤根部的一株内生菌(F4-20)入手,通过HPLC、LC-MS/MS证实次级代谢产物中含有雷公藤吉碱,并对内生菌培养发酵条件进行了优化,以期提高其杀虫活性和雷公藤吉碱含量,为其工业化发酵生产作准备。现将结果总结如下:1.在不同温度、初始pH、碳源、氮源和生长素的条件下,通过检测菌落生长的情况,对F4-20菌株固体培养条件进行了优化。结果表明,F4-20固体培养的最适温度为20℃;不同碳源培养基中,以葡萄糖作为碳源时菌落生长最快,培养20 d后菌落直径为4.47 cm;不同氮源培养基中,豆粉作为氮源时菌落生长最快,培养20 d后菌落直径为5.54cm;培养基的最佳初始pH值为8.5,最佳生长素为萘乙酸(NAA)。2.采用高效液相(HPLC)与液相色谱-质谱/质谱联用(LC-MS/MS)检测,结果显示,F4-20的次级代谢产物中含有雷公藤吉碱。采用E培养基(ISP2),F4-20次级代谢产物中,雷公藤吉碱(wilforgine)的含量可达44.2μg/g。3.以杀虫活性与菌丝干重为指标,对F4-20菌株发酵培养的基础培养基进行了筛选。结果表明,培养基H为F4-20菌株的最佳基础培养基,培养7 d后,菌丝干重达8.89 mg/mL,菌丝提取物对3龄蚊幼和月季长管蚜的杀虫活性分别为95.67%和58.34%;在基础培养基H的基础上,通过单因素试验对发酵培养基的最佳碳源和氮源进行了筛选。结果表明,葡萄糖和蛋白胨为F4-20菌株发酵培养的最佳碳源和氮源;在最佳碳源和氮源筛选的基础上,以菌丝干重为指标,采用响应面分析法对F4-20菌株的发酵培养基进行了优化,结果表明,当葡萄糖为35.7 g/L、蛋白胨26 g/L、七水合硫酸镁0.059 g/L、氯化钠2.38 g/L、磷酸二氢钾1.19 g/L、碳酸钙2.38 g/L、硫酸铵2.97 g/L时,最有利于F4-20菌株的生长,发酵7d后,菌丝干重可达13.05mg/mL。在此基础上,以菌丝干重为指标,利用响应面分析法对F4-20菌株的摇瓶发酵条件进行了优化。结果表明,F4-20菌株摇瓶发酵的最佳条件为,转速140rmp/min,初始pH 7.5,接种量9.04%,装液量94.2 mL/250mL,在此条件下,培养7 d后菌丝干重到最大值 15.93 mg/mL。4.F4-20菌株在ISP2培养基发酵培养的过程中,添加MeJA、SA、H202、GSH四种诱导子,测定外源诱导子对F4-20菌株生长和雷公藤吉碱产生的影响。结果表明,MeJA、H202、SA有不同程度的抑制生长作用,而添加GSH后显著促进生长。添加3 mM的GSH处后,菌丝的鲜重最大(4.72±0.40g),为对照的1.39倍(3.40±0.07 g)。添加MeJA、GSH,雷公藤吉碱在F4-20菌丝体含量有所降低,但加入H202、SA经诱导含量增高。添加100μ 的SA后,雷公藤吉碱可达45.91±1.26 g,为对照的1.42倍(32.39±2.61 μg/g)。5.内生菌F4-20在5 L、15 L及70 L发酵罐中进行了发酵培养,结果表明,不同的搅拌转速、通气量和发酵罐工称容积对雷公藤内生菌F4-20的生长代谢有较大影响。在5L发酵罐中,搅拌速度200 rpm/min、通气量2.5 L/min时,有利于F4-20的生长和代谢,在此条件下发酵10 d,菌丝干重为12.94 mg/mL;菌丝干样浓度为0.15 g/mL时,对月季长管蚜的杀虫活性为56.61%。在15L发酵罐中,搅拌速度200 r/min、通气量10 L/min,采用发酵培养基和ISP2培养基发酵培养时,菌丝干重分别为6.02 mg/mL、2.02 mg/mL;菌丝干样浓度为0.15 g/mL时,对月季长管蚜的杀虫活性分别为47.09%和52.87%。在70L发酵罐中,搅拌速度150rmp/min、通气量40L/min时,菌丝干重为2.43 mg/mL,菌丝干样浓度为0.15 g/mL时,对月季长管蚜的杀虫活性为37.57%。6.通过PCR技术对F4-20菌株16SrDNA全序列进行扩增并测序,将此序列与GenBank中该类菌部分已知种的16SrDNA序列进行同源性比较,通过构建的系统发育树,发现该株菌与链霉菌Blastomycetica strain NRRL B-5480具有高度同一性(98%)。结合前期生理生化等特征的鉴定结果,确定F4-20属于放线菌链霉菌属的菌株。