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DNA甲基化是一种重要的表观遗传机制,在不改变DNA分子一级结构的情况下调节基因的功能。植物中主要包括四种胞嘧啶甲基转移酶:维持DNA甲基转移酶METs家族、结构域重组甲基化酶DRMs、染色质甲基化酶CMTs与DNA甲基转移酶Dnmt2家族。花青苷是蓝莓主要的代谢产物之一,具有重要的营养和市场价值。目前有关蓝莓花青苷研究主要集中在合成路径调控与代谢、提取方法的改进等,鲜有关于DNA甲基化和去甲基化基因对花青苷生物合成的影响。本实验选取南高丛蓝莓品种’奥尼尔’和’蓝雨’为研究试材,分离DNA甲基化、去甲基化以及花青苷合成相关基因,采用实时荧光定量法(qPCR)分析各基因在果实生长发育阶段的表达水平,通过比较转色期前后花青苷含量差异,以及花青苷合成关键基因启动子中的甲基化变化,分析DNA甲基化和去甲基化基因对花青苷生物合成可能的影响。具体研究结果如下:(1)分别分离出蓝莓DNA甲基化基因VcMET1、VcDRM2、VcCMT3和去甲基化基因VcDME1cDNA序列各一条。分析推导的氨基酸序列发现,4个基因均包含植物中高度保守的结构域:VcMETl包含2个N端调控区的复制叉作用位点DNMT1-RFD结构域,2个参与DNA甲基化、复制与转录调控的BAH及1个胞嘧啶甲基转移酶Dcm结构域;VcDRM2包含1个泛素相关结构域UBA与1个S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶结构域;VcCMT3分别包含1个BAH、Dcm及染色质结构修饰结构域CHROMO;VcDMEI分别包含1个RRM_DME,一个编码螺旋发夹结构的HHH super family以及一个可被Demeter-like蛋白探测的Perm-CXXC蛋白结构域。qPCR分析发现,VcMET1和VcCMT3随着果实的发育表达量逐渐下降,在果实发育的后期甚至检测不到;除在’蓝雨’ S6和S7期高表达外,VcDRM2在整个果实发育期间mRNAs相对较低,且呈平缓下降状态;与DNA甲基化基因类似,去甲基化基因VcDME1在果实发育时期阶段的表达也呈现下降趋势。(2)根据报道的蓝莓花青苷合成相关基因VcANS、FcDFR、VcCHS、VcF3H和VcUFGT基因序列,分离并研究这些基因在’奥尼尔’与‘蓝雨’果实发育进程中的表达模式,发现其表达模式上高度一致,呈现上升-下降-上升-下降的动力学变化趋势。(3)蓝莓果实中花青苷主要积累在果皮,果实从S5期开始积累花青苷,随后花青苷含量迅速增加;S5期果实呈白色或浅绿色,Br期1/4的蓝莓果实呈浅红或浅紫色,到S6期果实转变成深蓝色。pH示差法分析表明3个时期花青苷的含量分别是0.005、0.22和2.63 mg/g.FW。比较同时期花青苷生物合成相关基因的表达,发现这些基因在花青苷积累之前表达丰度较高,花青苷的积累对其基因表达呈现反馈调控。(4)采用同源克隆法分离出’奥尼尔’与’蓝雨’花青苷合成相关基因VcANS、VcDFR、VcCHS、VcF3HccUFGT启动子序列;利用启动子分析软件PlantCARE预测发现,光响应元件占40.30%,推测蓝莓花青苷生物合成受光信号影响较大。(5)对花青苷合成相关基因VcANS和FcCHS启动子序列的胞嘧啶变化分析发现,VcANS启动子从S5期-Br期-S6期中分别有2个、10个和8个胞嘧啶被甲基化,在转色期前后仅在3个转录起始位点(两个TATA-box和一个CAAT-box)发生改变;VcCHS启动子从S5期-Br期-S6期中分别有2个、2个和4个胞嘧啶被甲基化;另外,VcANS和VcCHS启动子甲基化位点分别存在序列反义链上的CAAT-box区域和5’-UTR Py-rich stretch区域,属于高转录水平的顺式作用元件,影响花青苷相关基因的转录表达,推测低甲基化状态下的启动子序列促进基因的表达。