【摘 要】
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【目的】研究显示脂肪干细胞来源的外泌体（ASC-Exos）能有效地预防大鼠肩袖撕裂后的肌肉萎缩和退变,但其对人体撕裂肩袖肌腱组织的作用及其可能的机制尚不明确。本实验旨在研究ASC-Exos对人体肩袖肌腱撕裂后组织代谢活动的影响,并探讨其可能的作用机制【方法】从15名平均年龄为65.8±3.2岁,需要反式肩关节置换手术的患者中获取撕裂的冈上肌肌腱组织。将获取的每个肌腱切割成3×4×4 mm的外植体,
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【目的】研究显示脂肪干细胞来源的外泌体（ASC-Exos）能有效地预防大鼠肩袖撕裂后的肌肉萎缩和退变,但其对人体撕裂肩袖肌腱组织的作用及其可能的机制尚不明确。本实验旨在研究ASC-Exos对人体肩袖肌腱撕裂后组织代谢活动的影响,并探讨其可能的作用机制【方法】从15名平均年龄为65.8±3.2岁,需要反式肩关节置换手术的患者中获取撕裂的冈上肌肌腱组织。将获取的每个肌腱切割成3×4×4 mm的外植体,将来自同一肌腱的外植体置于12孔板中,在完全培养基（对照）或含有ASC-Exos的完全培养基中培养72小时.然后,使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量外植体分泌到培养基中的细胞因子的浓度,包括白细胞介素1β（IL-1β）、IL-6、IL-8和基质金属蛋白酶9（MMP-9）。肌腱用苏木精和伊红染色,并用免疫组化（Ⅰ型和Ⅲ型胶原）进行组织学分析。采用实时定量聚合酶链反应法检测肌腱合成代谢基因（TIMP-1和TIMP-3、Ⅰ型和Ⅲ型胶原编码）和分解代谢基因（MMP-9和MMP-13）的差异表达。采用蛋白印迹法检测磷酸化的AMPKα和Wnt/β-连环蛋白通路,探讨ASC-Exos的潜在作用机制。【结果】1、成功分离ASC-Exos:通过透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析,可以观察到杯状囊泡,大部分颗粒大小分布在30到150 nm之间。蛋白印迹分析显示这些囊泡高表达CD9、CD63、TSG-101和Alix。这证明本研究成功地分离了ASC-Exos。2、促炎细胞因子的分泌:和对照组相比,ASC-Exos组IL-1β、IL-6和MMP-9的分泌较对照组显著减少（P＜0.05）。两组间IL-8的分泌无明显差异。3、组织学分析:定性分析:苏木精-伊红染色后,与ASC-Exos组相比,对照组的肌腱表现出更明显的胶原纤维的解离、分离和变薄。此外,对照组的细胞增生和血管增多更为明显（图3A）。半定量分析:半定量分析显示ASC-Exos组的组织学评分（19.0 6±2.4）)明显高于对照组（13.4±4.0,P＜0.05）。定量分析结果显示,ASC-Exos组Ⅰ型胶原的平均光密度（0.08±0.02）明显高于对照组（0.04±0.02;P＜0.05）。组间Ⅲ型胶原的平均吸光度无显著差异（ASC-Exos组,0.07±0.01;对照组,0.08±0.01）4、合成代谢基因表达:与对照组相比,ASC-Exos显著提高了Ⅰ型和Ⅲ型胶原编码基因的表达水平,分别为对照组的3.4倍和2.7倍。在ASC-Exos组里第Ⅰ/Ⅲ类比率也是对照组的1.2倍。TIMP-1和TIMP-3基因在ASC-Exos组和对照组之间的表达没有显著差异。5、分解代谢基因表达:与对照组相比,ASC-Exos显著降低了MMP-9和MMP-13的基因表达水平,分别为0.6和0.8。分解代谢基因表达:与对照组相比,ASC-Exos显著降低了MMP-9和MMP-13的基因表达水平,分别为0.6和0.8。6、潜在的信号通路:Western blotting数据显示ASC-Exos组的p-AMPKamRNA表达升高,β-catenin表达降低。与对照组相比,ASC-Exos组的促炎细胞因子,包括IL-1β、IL-6和MMP-9的分泌显著减少。ASC-Exos组冈上肌腱表现出优越的组织学特性,肌腱成熟评分较高,Ⅰ型胶原含量较高,但各组间Ⅲ型胶原蛋白含量无显著性差异。ASC-Exos组中MMP-9和MMP-13基因的表达较对照组有所降低。与对照组相比,ASC-Exos组的Ⅰ型和Ⅲ型胶原表达增加,I/Ⅲ型比值升高。ASC-Exos组与对照组IL-8分泌、TIMP-1和TIMP-3基因表达均无统计学差异。蛋白印迹实验结果显示,ASC-Exos可增强磷酸化的AMPKα（一磷酸腺苷活化的蛋白激酶）,降低β-连环蛋白水平,以防止肌腱变性。【结论】ASC-Exos可以通过抑制分解代谢和促进合成代谢来维持人撕裂肩袖肌腱代谢稳态,以改善其组织学特性,通过增强AMPK信号通路和抑制Wnt/β-连环蛋白的活性来实现的。ASC-Exos可以作为一种有效的生物治疗方案有望用来促进人撕裂肩袖肌腱的愈合。
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