凝乳酶是干酪生产过程中的关键酶,随着干酪的市场需求不断增加,小牛凝乳酶逐渐供不应求,人们不得不寻找其替代品。骆驼凝乳酶、羔羊凝乳酶、猪胃蛋白酶等动物源凝乳酶都具有较好的凝乳活力,它们的蛋白水解力较小,制作的干酪苦味小,风味和品质也较好。帕尔玛奶酪、高山奶酪、埃门塔尔奶酪等很多高品质的干酪都使用动物源凝乳酶进行制作。实验室前期发现,黄粉虫中肠匀浆液和后肠匀浆液凝乳活力具有明显差异,但对该现象没有深入探讨,其凝乳机理未做进一步的研究。本试验通过蛋白组学技术、分离纯化、Edman降解等方法分析了造成黄粉虫中、后肠的凝乳差异的原因,测定了起主要凝乳作用的蛋白酶的酶学性质,分析了不同Ca2+浓度对该蛋白酶凝乳特性的影响,预测了该蛋白酶的高级结构。本研究的主要结果如下:1.分析了黄粉中肠和后肠匀浆液的蛋白组差异。液相色谱串联质谱技术（liquid chromatography coupled with two-dimensional mass spectrometry,LC MS/MS）分析表明,黄粉虫的肠道中共有1207种蛋白质,其中223种为差异表达蛋白,112种在中肠中具有更高的表达量（上调蛋白）,其余111种在后肠中表达量更高（下调蛋白）。上调蛋白的功能（Gene Ontology terms,GO terms）主要与细胞过程,代谢过程和催化活性等相关,其中的催化活性主要与半胱氨酸型内肽酶、丝氨酸型肽酶、丝氨酸型内肽酶、金属内肽酶相关;下调蛋白的功能主要与遗传信息处理,碳水化合物代谢,辅助因子和维生素的代谢等相关。通过离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化得到了凝乳蛋白酶,经验证达到了电泳纯。Edman降解法分析表明,该蛋白酶的N端15个氨基酸序列MKLLVFSLVAISLAQ。通过序列比对发现,该蛋白酶的N端序列与蛋白组数据库PXD029111中的一种蛋白（g18990）完全吻合。2.对黄粉虫凝乳蛋白酶的理化性质和结构进行预测研究。理化性质预测分析表明,该酶的等电点为4.22,是一种酸性蛋白酶;净电荷为-18;不稳定性指数为31.49,说明该酶性质稳定;疏水性氨基酸比例为43.37%。黄粉虫凝乳蛋白酶的二级结构预测表明,其与小牛凝乳酶和骆驼凝乳酶的相比差别很大,α螺旋占比较高;构建了其三维结构模型,该模型的外层大多是α螺旋和一些无规则卷曲,而酶分子的β折叠结构占据了内部的大部分位置,并构成了一个夹层,其中包裹着该酶的活性位点。3.对黄粉虫凝乳蛋白酶的酶学性质进行了研究。该酶的最适温度为65℃,最适p H为5.5,能够在35-45℃之间保持酶活稳定,在p H 3.0-6.0保持酶活稳定,最适Ca2+浓度为55m M,最适底物浓度为2.5%,Na+和Ca2+对该酶酶活力有促进作用,Cu2+、K+、Mg2+、Zn2+、Mn2+均会抑制酶活力;该酶以酪蛋白为底物的米氏常数Km为1.39 g/L;通过蛋白抑制剂试验发现,该酶的水解活力被PMSF降低超过90%,因此该酶是一种丝氨酸蛋白酶;该酶水解κ酪蛋白的主要水解位点为Lys116-Thr117。4.研究了Ca2+对黄粉虫凝乳蛋白酶凝乳特性的影响。随着脱脂乳样品中Ca2+浓度由10m M增长到45m M,加入黄粉虫凝乳蛋白酶的脱脂乳样品的表观粘度、浊度、持水力呈现递增趋势,增至35m M达到峰值,之后开始下降;脱脂乳样品的粒径值在35m M Ca2+浓度下达到最大,在40-45m M Ca2+浓度下开始降低。综上所述,大量蛋白水解酶在黄粉虫中肠富集,在后肠中表达量很低,导致了两者的凝乳差异,这些蛋白水解酶中存在一种凝乳蛋白酶,该酶是一种丝氨酸型内肽酶,其主要水解κ酪蛋白的Lys116-Thr117位点,N端15个氨基酸序列MKLLVFSLVAISLAQ。该酶具有高C/P值和低酸p H稳定性,但热稳定性一般,酶学性质较为优良,Ca2+可以显著提升该酶的凝乳性能,该酶的理化性质稳定,三维结构稳定,但活性位点被包裹。研究结果可为黄粉虫凝乳蛋白酶在干酪或其他乳制品的应用提供理论依据和参考。