结直肠癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤之一。诸多类型肿瘤中，结直肠癌的分子机理研究开展比较早，研究得相对比较清楚。自Vogelstein提出经典的结直肠癌的多步骤、多基因的发生发展模式以来，结直肠癌的分子病理学在不断发展，一系列与结直肠癌发生发展有关的基因被相继发现。近二十年来，随着我国居民生活方式和饮食结构的改变，结直肠癌的发病率和死亡率呈现上升的趋势，积极开展对结直肠癌相关分子的寻找，并进行功能研究，明确其在结直肠癌发生发展中的确切作用及其相关分子机制，对寻找结直肠癌的诊断、治疗、预后靶标有很重要的意义。结直肠癌的发生发展是个多步骤的过程，其中从正常粘膜-腺瘤-癌变途径是最重要的发生模式，探索上述过程中的基因表达改变对于加深我们对结直肠癌机理的认识有着重要意义。我们实验室于1999年原创性地运用抑制性差减杂交法(suppression subtractive hybridization，SSH)建立了三个结直肠癌相关差减文库：腺癌相对腺瘤(T-A)、腺癌相对正常粘膜(T-N)、腺瘤相对正常粘膜(A-N)，从中筛选出一系列在结肠癌的发生、发展过程中差异表达的基因，并进行后续的深入研究。胰岛素样生长因子结合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7)是在T-N文库中筛选频率较高、在腺癌中高表达的一个基因。我们前期运用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reactions，RT-PCR)法和免疫组化法检测证实IGFBP7mRNA以及蛋白水平在结直肠癌组织中高表达，但在结直肠癌细胞系却是低表达，在所检测的SW480、SW620、HT29、RKO、SW1116、HCT8、COLO205、Caco2、CW2、Hce8693中，IGFBP7只在SW480与Caco2细胞系中表达阳性。这个矛盾现象也给这个基因在结直肠癌里的真正作用添加了神秘色彩。本课题旨在通过两部分工作的研究：IGFBP7在结直肠癌细胞的生物学功能以及其引起的效应分子改变，明确其在结直肠癌中的生物学效应。IGFBP7在结直肠癌细胞系的低表达现象给了我们一个思路：将IGFBP7cDNA转染到不表达内源性IGFBP7的结直肠癌细胞中会产生怎样的变化?我们选用了具备不同遗传学背景的两株不表达内源性IGFBP7的RKO，SW620细胞作为我们的细胞模型。我们构建了PcDNA3.1(IGFBP7)真核表达载体，将其转染到RKO与SW620细胞，RT-PCR以及细胞分泌上清western blot证实了IGFBP7的表达。然后我们对其一系列生物学效应进行了检测分析，包括细胞生长实验、软琼脂克隆形成实验、凋亡相关检测。细胞计数试剂盒-8(cell counting kit，CCK-8)分析显示：IGFBP7可以抑制结直肠癌细胞的生长。IGFBPT-RKO，IGFBP7-SW620的转染株的生长速度要明显慢于转染空载体对照组(RKO：p=0.0066；SW620：p＜0.0001)。我们还比较了同一病人来源却具有不同IGFBP7表达谱的两株细胞SW480(来自原发灶，IGFBP7阳性)与SW620(来自转移灶，IGFBP7阴性)的生长速率。结果显示：IGFBP7阳性的SW480细胞的生长速率要明显慢于IGFBP7阴性SW620(p=0.0108)。软琼脂克隆形成实验显示：IGFBP7可以降低RKO与SW620的软琼脂克隆形成能力。细胞铺板软琼脂孵育三周后，我们进行＞100μm克隆计数。IGFBP7-RKO VS对照：平均12 VS 59，p=0.0004；IGFBP7-SW620 VS对照：平均18 VS 55，p=0.0026。同时，我们也观察到IGFBP7转染株的克隆要比对照组小，这也证实了我们上述关于IGFBP7是抑制结直肠癌细胞生长的结果。我们注意到，RKO细胞IGFBP7转染株与对照株的克隆大小差异更明显，这可能与两株细胞的基础背景特点不同有关，具体机理还有待深入研究。碘化丙锭(propidium iodide，PI)单染，PI/Annexin V双染的流式细胞术检测发现转染IGFBP7 48小时，细胞出现sub-G1峰，Armexin V阳性率增加，透射电镜对细胞内部形态的观察显示：转染IGFBP7以后，细胞出现核皱缩、染色质边聚的趋势，提示IGFBP7诱导细胞凋亡。免疫印迹显示IGFBP7在RKO细胞中可以引起Caspase-3表达增高，提示Caspase-3相关途径可能是IGFBP7在结直肠癌细胞中诱导凋亡的关键途径。我们发现的IGFBP7对结直肠癌细胞的生长抑制作用与其它实验室报道的该蛋白对其它肿瘤细胞，包括乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、宫颈癌细胞、骨肉瘤细胞等的生长抑制作用是相一致的。结合我们实验室近期关于结直肠癌组织中IGFBP7的表达与预后生存分析的结果：IGFBP7表达越高，病人的预后越好(p=0.012)，且IGFBP7是个独立评价预后因子，我们认为：IGFBP7是结直肠癌的保护因子，扮演着肿瘤抑制基因的角色。我们通过上述第一部分的实验明确了IGFBP7在结直肠癌中的抑癌的生物学功能。前期在进行IGFBP7在结直肠癌组织的研究时，我们意外地发现其表达水平与病人空腹血糖水平成正相关，提示IGFBP7是个与2型糖尿病相关的分子。其它实验室的研究也提示IGFBP7在前列腺癌、乳腺癌、肺癌中是个潜在的抑癌基因，同时近年来的研究也提示IGFBP7与胰岛素抵抗、2型糖尿病相关。迄今为止，IGFBP7在肿瘤和糖尿病的发生发展中具有重要生物学作用已经明确，但IGFBP7的深入分子机制一直未阐明。接下去我们的工作就是要探索IGFBP7上述生物学效应的分子机制，更深入客观地了解这个因子，为我们所观察检测到的IGFBP7相关生物学现象提供机制支持。为了客观深入地检测IGFBP7引起的结直肠癌细胞的内部变化，我们采用Affymetrix HG U133 plus 2.0全基因组芯片与双向凝胶电泳(two dimensional electrophoresis，2-D)技术从转录水平和翻译水平观察转染IGFBP7到RKO细胞后(IGFBP7转染株作为实验组，以空载体转染株作为对照组)引起的效应分子改变。为避免克隆间本身存在的差异，我们在每组中均挑取了三个克隆，组成三个配对组，每组用完全一样的培养条件，以减少外界环境带来的假阳性差异表达基因。Affymetrix芯片结果显示，在三组中具有重复性变化趋势的基因共有78个，我们对这些基因进行了Gene Ontology分析，发现了一系列非常有意思的现象。信号通路富集度分析显示：MAPK(Mitogen-Activated Protein Kinase)通路、胰岛素/IGF1(insulin-like growth factor 1)通路、TGF-β(transforming growth factor-β)通路显著富集，提示IGFBP7与相关通路关系密切。具体参与的基因是：MAPK通路：GADD45B(growth arrest and DNA-damage-inducible, beta), FOS(v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog), RASA1[RAS P21 protein activator(GTPase activating protein)1], FLNB[filamin B, beta(actin binding protein 278)], NR4A1(nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1)。主要涉及到：ERK1/2，JNK和p38 MAP激酶通路。胰岛素/IGF1通路：IRS1(insulin receptor substrate 1), RASA1[RAS p21 protein activator(GTPase activating protein)1], FOS(v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog)。其中RASA1与FOS属MAPK通路部分。TGF-β通路：CDKN2B[cyclin-dependent kinase inhibitor 2B(p15, inhibits CDK4)], ID1(inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein), ID3(inhibitor ofDNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein), SMAD3(SMAD family member 3)。我们用有向无环图(Directed Acyclic Graph，DAG)分析所筛基因的功能富集趋势，结果显示细胞骨架、actin相关基因显著富集，提示通过对细胞骨架的重塑也许是IGFBP7发挥其生物学效应的重要机制之一。IGFBP7引起细胞骨架相关基因改变与我们观察到的IGFBP7引起RKO细胞变狭长的形态改变相呼应，提示IGFBP7也许是通过对这些基因的影响进而引起细胞形态的改变。在三个克隆里具有一致性变化的基因有16个：包括IGFBP7, TAGLN(Transgelin), SP140(SP140 nuclear body protein), FRMD4A(FERM domain containing 4A), CALD(caldesmon 1), NAV3(neuron navigator 3), SOX9[SRY(sex determining region Y)-box 9(campomelic dysplasia, autosomal sex-reversal)], STC1(stanniocalcin 1), AREG[amphiregulin(schwannoma-derived growth factor)], ID1(inhibitor of DNA binding 1, dominant negative helix-loop-helix protein), IRS1, TACSTD(tumor-associated calcium signal transducer 1), IER5L(immediate early response 5-like), CDKN2B[cyclin-dependent kinase inhibitor 2B(p15, inhibits CDK4)], SYN1(synapsinⅠ), LAMB1(laminin, beta 1)。这些基因已经得到了荧光定量PCR的验证。我们又在另外一株结肠癌细胞株SW620中进行了这些基因的验证以明确IGFBP7引起的这些差异表达基因是否具有在结直肠癌细胞的广谱效应。结果发现，并不是所有验证的基因都具有一致的变化情况，提示着在不同细胞类型，IGFBP7会引起不同的下游分子改变。但IGFBP7上调AREG，P15，ID1，IER5L，IRS1，SOX9，STCI，SYN1，下调TAGLN在RKO，SW620中均获得验证，提示这些基因可能受IGFBP7的表达调控，有可能是IGFBP7的下游信号分子，对于我们将来深入的研究提供了重要的线索。双向凝胶电泳筛选差异表达蛋白显示：IGFBP7下调ALB(albumin), HSP60(60 kDa heat shock protein, mitochondrial precursor), Actin cytoplasmic 1或2，PKM2(pyruvate kinase, muscle), FARSB(phenylalanyl-tRNA synthetase, beta subunit)。信息覆盖量较少。唯有与芯片结果相互辉映的是：IGFBP7对actin有影响，进一步支持提示IGFBP7可能是个细胞骨架相关基因。通过我们以上关于IGFBP7在结直肠癌细胞的生物学功能研究以及效应分子初步探索，我们得出以下结论：1．IGFBP7对结直肠癌细胞具有抑制生长、降低软琼脂克隆形成能力、诱导凋亡的作用，在结直肠癌中扮演着抑癌角色。2．IGFBP7可能是个细胞骨架相关基因，通过对细胞骨架的重塑也许是IGFBF7发挥生物效应的一个重要机制之一。3．IGFBP7的可能信号通路是MAPK，胰岛素/IGF1，TGF-β相关通路。4．IGFBP7下调AREG、P15、ID1、IER5L、IRS1、SOX9、STC1、SYN1，上调TAGLN，这些基因可能是IGFBP7在结直肠癌细胞作用效应的关键靶基因。5．基因转染结合转录组、蛋白组的差异表达基因分析，对寻找基因的效应分子具有重要意义。