先天性巨结肠病（Hirschsprungdisease,HSCR）是最常见的先天性肠蠕动障碍疾病之一,其是由于肠神经嵴细胞（enteric neural crest cells,ENCCs）向远端肠管迁移失败导致的肠神经系统（enteric nervous system,ENS）发育障碍性疾病,基本病理改变是不同长度的远端肠管神经节缺失。由于缺乏神经节分布的肠管无法推进运动,且存在强直收缩,粪便和气体通过困难,因此会导致严重的慢性便秘、腹胀、生长衰竭（部分由于食物摄入减少）和胆汁性呕吐,严重者甚至出现肠穿孔和小肠结肠炎等并发症。该疾病发病率为1/5000,其中男性发病率较女性更为普遍（4:1）。目前HSCR的非保守治疗主要为切除病变肠管,但约1/3的术后患儿会出现便秘、大便失禁以及与HSCR相关的小肠结肠炎（Hirschsprung-associated enterocolitis,HAEC）等并发症。以RET基因异常为代表的“基因突变学说”是被大家广泛认可的HSCR发病机制之一。RET作为HSCR发病的主要易感基因,其突变比例约占家族性病例的40-60%,在散发病例中约占7%-25%,其它参与编码肠神经节发育的基因及配体异常约占散发性病例的30%。因此,单一“基因突变学说”已经无法完全覆盖HSCR的发病机制,进一步探讨HSCR的发病机制对于寻求更加完善的治疗方案具有重要意义。目前,越来越多的研究表明HSCR的发生发展与肠道微环境和肠神经嵴细胞（enteric neural crest-derived cells,ENCCs）间异常的相互作用密切相关,即“肠道微环境”学说。细胞外基质（Extracellularmatrix,ECM）作为细胞微环境的四大组成成分之一,不仅是细胞的结构骨架,而且是触发和调节细胞行为的3D生物物理触发器。胚胎时期,在ENCCs沿发育的迷走神经干迁移至整个消化道的过程中,ECM稳态的丧失可导致ENCCs的移行受阻或过早完成定植、分化,造成结肠远端出现无神经节段肠管。ENCCs迁移停顿时间越早,就会导致狭窄段出现的部位越高、病变肠管越长,并且ENCCs的这一迁移过程与肠壁微环境密切相关。在阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）、帕金森病（Parkinson’s disease,PD）和亨廷顿病（Huntington’s disease,HD）等伴有HSCR症状的中枢神经系统（Central Nervous Systerm,CNS）退行性疾病中均存在不同程度的ECM稳态丧失。内皮素 3（Endothelin-3,ET3）和内皮素 B 受体（Endothelin receptor B,EDNRB）突变小鼠体内神经节间充质中层粘连蛋白的过分累积有效抑制了 ENS的迁移。选择性抑制小鼠ENCCs中β1整联蛋白基因的表达可导致其迁移受损、异常聚集,出现结肠无神经节细胞症。但肠道ECM调节ENS发育的同时,ENCCs也可影响ECM的组成。例如,在ENS发育过程中,ENCCs可分泌基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteases,MMP）和腱生蛋白 C（tenascin C）等促进 ENCCs 的迁移。综上所述,ENCCs积极塑造了其迁移过程中周边的ECM环境,同时这些环境变化反过来规范了 ENCCs的发展。由结肠间质细胞产生的纤维粘连蛋白（Fibronectin,FN）是ECM的关键糖蛋白之一,在调节神经崤细胞迁移和分化过程中发挥着至关重要的作用。神经连接蛋白-1（neuroligin-l,NL-1）和神经连接蛋白-2（neuroligin-2,NL-2）属于神经连接蛋白（neuroligin,NLs）家族,位于突触后膜上,分别调控兴奋性和抑制性突触的形成。我们的前期研究验证了 HSCR患儿病变肠管中FN和NLs的表达存在异常,但FN在HSCR发病中的作用以及是否与NLs间存在调控关系尚不明确。胶原蛋白（collagen,Col）是哺乳动物系统中含量最丰富的蛋白质,为多种器官和组织提供必要的结构框架和功能支撑。其中,Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ）是ECM含量最丰富的蛋白质之一,其与Ⅲ型胶原蛋白（Col Ⅲ）共同组成纤维;Ⅳ型胶原蛋白（Col Ⅳ）是基底膜的主要构成成分,在维持肠上皮完整性、肠道形态和功能中扮演重要角色。若胶原蛋白出现异常,将会导致相对应的组织出现病理性变化。虽然现在关于胶原蛋白与ENS发育及HSCR发病机制的研究日益增多,但迄今为止尚未有研究直接涉及Col Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ在HSCR患儿结肠组织中的表达情况。本课题突破了原有基因异常单一因素分析HSCR发病的局限性,从ECM与ENCCs间相互调控对HSCR发病的影响入手,希望进一步补充完善“肠道微环境”学说。本课题共分为两部分,分别研究HSCR患儿结肠组织中FN与ENS突触间的相互影响以及Col Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ在HSCR患儿病变肠管中的表达情况,旨在为HSCR疾病的发生发展提供新的理论基础。第一部分:纤维粘连蛋白在HSCR中的作用及机制研究目的1.探究HSCR患者狭窄段、移行段及扩张段三部分结肠组织中FN和突触的分布情况及功能变化,明确FN对兴奋性和抑制性突触的调控机制以及其在HSCR发生发展中的作用;2.探究不同胎龄胚胎鼠肠管中FN和NLs的表达情况,分析二者表达水平同胚胎鼠胎龄间的相关性;3.探究细胞水平FN和NLs的相互作用关系,为HSCR疾病的发生发展提供新的视角。方法1.检测HSCR患者结肠狭窄段、移行段和扩张段三部分组织中FN和兴奋性/抑制性突触标志物的表达情况取HSCR患者狭窄段、移行段和扩张段的结肠组织,分别利用实时荧光定量PCR（Quantitive Real-time PCR,qRT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western Blot,WB）技术检测FN和突触相关标记物的mRNA和蛋白质表达水平。利用免疫组化方法（immunohistochemistry,IHC）检测这三部分结肠组织中FN和突触相关标志物的表达部位、蛋白表达强度及阳性染色面积占比（视野范围内阳性染色面积/视野范围内所有组织面积）情况。2.体外培养PC12细胞,敲低FN基因表达,检测突触相关标志物的表达情况PC12细胞中转染FN-siRNA和阴性对照NC-siRNA,利用qRT-PCR、WB和免疫荧光（Immunofluorescence,IF）技术,检测兴奋性突触标志物NL1、PSD-95、vGLUTl、GluAl、GluN1 和抑制性突触标志物 NL2、SLC32、GABA AR-α1、GAD67的表达水平。3.含有高浓度FN的培养基体外培养胚胎鼠结肠组织,检测结肠突触标志物的表达情况取30只处于胚胎期第20天（E20）的健康Wistar大孕鼠,取其胚胎鼠末端结肠置于含有20 μg/mL FN功能结构域氨基酸片段（Arginine-glycine-aspartic acid,RGD）的完全培养基中,分别进行体外结肠组织培养0、0.5、1、2、4、6、8、12 h,通过WB和IHC染色分析结肠肌间神经丛兴奋性突触标志物PSD-95和抑制性突触标志物SLC32的蛋白表达水平。4.探讨不同胎龄胚胎鼠ENS中FN与NLs的表达情况,并分别与胚胎鼠胎龄进行相关性分析分别取孕16天（E16）、孕18天（E18）、孕20天（E20）的胚胎鼠和出生24 h以内乳鼠（Ep0）的远端结肠组织,利用qRT-PCR和WB技术检测四个时间段胚胎鼠结肠组织中FN与NLs的mRNA和蛋白表达水平,并将它们的蛋白表达水平分别与胚胎鼠胎龄进行相关性分析。5.体外培养PC12细胞,敲低NL1和NL2基因表达,检测FN的表达情况PC12 细胞中分别转染 NL1-siRNA、NL2-siRNA、NL1+NL2-siRNA 和阴性对照NC-siRNA,利用qRT-PCR和WB方法检测不同条件下FN的mRNA和蛋白表达水平。结果1.HSCR患者结肠狭窄段、移行段至扩张段中兴奋性/抑制性突触标志物基因和蛋白水平明显升高,FN的则明显下降qRT-PCR和WB结果显示在HSCR患者结肠狭窄段、移行段至扩张段三部分组织中,兴奋性突触相关标志物（NL1、PSD-95、vGLUT1、GLUA1、GLUN1）和抑制性突触相关标记物（NL2、SLC32、GABAAR-α1、GAD67）的mRNA和蛋白表达水平均逐渐增高,FN的表达水平逐渐降低;IHC染色结果显示,PSD-95 和 SLC32 免疫反应强度自扩张段、移行段到狭窄段逐渐降低,FN 的免疫反应强度则在狭窄段最强,扩张段最弱;阳性染色面积占比表明突触占比自扩张段、移行段到狭窄段逐渐降低,而FN的占比逐渐升高。2.抑制FN的表达可促进PC12细胞突触相关标志物的表达敲低PC12细胞中FN的表达,qRT-PCR、WB和IF结果显示,细胞内NL1、NL2、PSD-95、vGLUT1以及SLC32的mRNA和蛋白水平较阴性对照组均显著升高。3.FN显著抑制了结肠肌间神经丛突触标志物的表达水平将30只孕20天（E20）胚胎鼠末端结肠组织置于含20 μg/mL RGD的完全培养基中进行体外培养0、0.5、1、2、4、6、8和12 h,提取组织蛋白。WB结果显示,PSD-95和SLC32的蛋白表达水平在6 h时呈最低。进一步将RGD刺激Oh和6 h的胚胎结肠组织进行IHC染色,结果表明:与培养Oh的结肠组织相比,培养6h的结肠组织内PSD-95和SLC32表达水平显著下降。4.随着胚胎鼠胎龄的增加,肠管中FN的表达明显下降,NLs的表达明显增加,且FN和NLs的蛋白表达水平同胚胎鼠胎龄密切相关qRT-PCR和WB结果显示:随着胚胎发育胎龄增加,胚胎鼠结肠组织中NL1与NL2的mRNA和蛋白水平逐渐升高,FN的表达水平逐渐降低。相关性分析结果表明:胎鼠胎龄与其结肠组织中FN的蛋白表达水平呈负相关,与NL1/NL2的蛋白表达水平呈正相关。5.PC12细胞中FN与NLs互为反向调控分别敲低PC12细胞中NL1和NL2的表达后,qRT-PCR和WB结果显示细胞内FN的mRNA和蛋白表达水平明显升高。结合敲低PC12细胞中FN的相关试验结果,证实PC12细胞中FN与NLs互为反向调控。同时敲低PC12细胞中NL1和NL2的表达后,细胞内FN蛋白表达水平与仅敲低NL1或NL2时无明显差异,即NL1和NL2对FN不具联合抑制效果。结论1.HSCR患者结肠狭窄段、移行段至扩张段组织中,兴奋性/抑制性突触标志物基因和蛋白水平逐渐升高,FN表达水平逐渐降低。2.敲低PC12中FN的表达可促进突触相关标志物的表达。3.体外培养胎鼠结肠组织,培养基中FN可显著抑制肌间神经丛突触标志物的表达水平。4.随着胚胎鼠胎龄的增加,肠管中FN蛋白和基因表达水平显著下降,NLs表达显著升高,并且FN和NLs的蛋白表达水平同胚胎鼠胎龄密切相关。5.PC12细胞中FN与NLs互为反向调控,且NL1和NL2对FN不具联合抑制效果。第二部分:Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型胶原蛋白在HSCR中的表达目的探究HSCR患儿病变肠管中Col Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的表达情况。方法Col Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ在HSCR中的表达情况:随机抽取30个术后病理结果确诊为HSCR患儿的结肠标本作为研究对象,利用qRT-PCR和WB检测Col Ⅰ、ColⅢ和Col Ⅳ在扩张段、移行段和狭窄段三部分结肠组织中mRNA和蛋白质的表达情况。同批标本行IF双重染色分析直观呈现Col Ⅰ、Col Ⅲ和Col Ⅳ与肌间神经节的位置关系及表达水平。结果在HSCR患儿扩张段、移行段和狭窄段三部分组织中,Col Ⅰ和Ⅲ的表达水平逐渐降低,Col Ⅳ的表达水平逐渐升高qRT-PCR和WB结果显示:Col Ⅰ和Col Ⅲ的mRNA和蛋白表达水平在扩张段组织中最高,移行段次之,狭窄段最低;Col Ⅳ的表达水平则在狭窄段组织中最高,移行段次之,扩张段最低。IF结果显示:ColⅠ和Col Ⅲ主要表达于肌间神经节内部及其周边位置,其免疫反应强度由狭窄段至扩张段逐渐增加;ColⅣ的显影位置与Col Ⅰ和Col Ⅲ无明显差异,但是其免疫反应强度则由扩张段至狭窄段逐渐降低。结论1.在HSCR患儿病变肠管中,ColⅠ、Ⅲ和Ⅳ表达异常。2.在HSCR病变肠管肌层间,Col Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ主要表达于肌间神经节内部及其周边位置。