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目的: 本研究利用α-半水硫酸钙与鹿瓜多肽注射液,按照一定的比例,经过特定的复合过程,将其转化为具有生物活性的复合人工骨材料。并从材料的理化性质、生物相容性以及成骨活性三方面对制备的骨材料进行检测。本研究为进一步研究硫酸钙的骨缺损修复机制和临床上应用这种骨材料提供初步的实验研究基础。 方法: 一、硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料的制备及理化性质检测。 将鹿瓜多肽注射液与双蒸水分别按照1∶0、1∶1、1∶2的比例混合均匀,作为固化液。然后将α-半水硫酸钙适量固化液混合,充分搅拌混匀,至混合物呈凝胶状后,将浆料注入不同规格的模具内,常温下待液体挥发,固化,最后环氧乙烷消毒。扫描电镜下观察材料表面形态,压力测试仪检测复合人工骨的抗压性能。 二、硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料的生物相容性研究。 根据体外材料毒性评价标准IS010993-5及GB/T16886-1,从细胞水平和动物水平两方面进行以下实验:A、CCK8细胞毒性试验,B、电镜下细胞在材料表面粘附试验,C、体内急性毒性反应试验,D、溶血实验,E、骨缺损植入试验。 三、硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料的成骨活性研究 从体内和体外两方面实验综合评价硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料的成骨活性 A、体外试验:以复合人工骨的培养基浸出液来培养成骨细胞,ALP试验评价成骨细胞增殖活性,Q rt-pcr检测相关成骨活性因子的表达水平。B、体内试验:制作兔股骨远端骨缺损模型,然后分对照组和不同的实验组,各组分别植入相关的人工骨,分批于术后2周、4周、8周及12周处死,观察以下指标:1、动物一般情况观察;2、术前及术后各时间点平片观察人工骨的降解以及新骨形成的情况;3、标本常规病理切片,HE染色观察成骨情况。 结果: 一、硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料的制备及理化性质检测。 按照上述制备方法,得到不同规格的人工骨材料。电镜下观察见材料表面硫酸钙晶体排列紧密。抗压试验表明复合人工骨的抗压强度能够为骨缺损处提供足够的支撑。 二、硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料的生物相容性研究。 A、CCK8细胞毒性试验:与单纯硫酸钙对照组相比,实验组的成骨细胞增殖更加活跃。B、电镜下细胞在材料表面粘附试验:扫描电镜下可见成骨细胞在材料表面粘附,呈梭形,形态饱满,并有大量伪足伸出,细胞间有突起相连。细胞种植后第3天与第7天电镜结果相比,可见成骨细胞增殖明显。C、体内急性毒性反应试验:实验兔子的心肝肺肾等重要脏器均表现正常,未见正常细胞坏死及炎症细胞浸润等现象。D、溶血实验:人工骨材料植入机体后不会引起溶血反应。E、骨缺损植入试验:病理切片显示材料周围的组织情况良好,未见明显的炎症细胞浸润。 三、硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料的成骨活性研究 A:实验组ALP活性明显升高。人工骨材料能够提高成骨细胞BMP-2、TGF-β等成骨活性因子的表达,具有一定的骨诱导活性。B:1、动物一般情况观察:人工骨材料植入后,兔子全身情况稳定,未见异常反应,手术切口正常愈合,无感染,术后动物均正常生长,未见死亡。2、平片观察:实验组2周时骨缺损区清晰,4周时有少量骨痂形成;术后8周时,难以见到植入的人工骨,骨缺损区内骨痂逐渐增多;12周时骨缺损区内有大量新生骨质填充,骨缺损基本修复。硫酸钙组各时期成骨要慢于实验组。3、病理切片:实验组2周时见材料外层极少量纤维组织形成,4周时见材料外层降解,大量纤维组织形成。可见少量新骨形成,8周时材料大部分降解,新骨量明显增加,12周新骨基本填充骨缺损。 结论: 一.硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料晶体结合紧密。具有一定的抗压强度,符合人工骨的抗压要求。 二.硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料的生物相容性良好。 三.硫酸钙/鹿瓜多肽复合人工骨材料具有一定骨诱导活性,成骨能力良好。