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“肿瘤细胞靶向机制”与“肿瘤新生血管靶向机制”相结合,是针对肿瘤病灶具有较高特异性的靶向机制,近年来受到学界的广泛关注。就二者的结合形式而言,现有的“肿瘤双重靶向机制”存在“靶细胞内吞效率与长循环效应难以两全(PEG悖论)”以及“肿瘤细胞表面受体饱和导致递药系统在肿瘤细胞的内吞效率下降”等缺陷。本文以c[RGDyk]修饰的pH敏感长循环脂质体包载载阿霉素的功能性PAMAM树状大分子,构建了一种肿瘤分级靶向PAMAM.复合脂质纳米递药系统(c[RGDyk]-PEG2000-PSL[PAMAM G5.0-AC80-FITC5-FA5/DOX],简称“cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]”),旨在利用其“肿瘤分级靶向机制(先靶向肿瘤组织,再靶向肿瘤细胞)”克服上述“肿瘤双重靶向机制”的缺陷,有效提高递药系统的肿瘤靶向效率。论文的研究包括以下七个部分:①PAMAM G5.0树状大分子的合成与表征;②PAMAM G5.0 功能性化学修饰产物(PAMAM G5.0-AC80-FITC5-FA5,简称“ND”),以及整合素αυβ3导向磷脂(DSPE-PEG2000-c[RGDyk])的合成与表征;③载阿霉素肿瘤分级靶向PAMAM复合脂质纳米递药系统(cRGD-PEG-PSL[ND/DOX])的构建及其制剂学性质研究;④肿瘤分级靶向PAMAM复合脂质纳米递药系统的体外“肿瘤分级靶向机制”研究;⑤载阿霉素肿瘤分级靶向PAMAM复合脂质纳米递药系统的体内药动学考察,及其组织分布行为研究;⑥载阿霉素肿瘤分级靶向PAMAM复合脂质纳米递药系统的体内外药效学评价;⑦空白肿瘤分级靶向PAMAM复合脂质纳米递药系统的体外细胞毒性研究。采用发散法合成了 PAMAM G5.0树状大分子,并应用透析方法对整代PAMAM合成产物进行了纯化。应用傅里叶变换红外分光光度法(FT-IR)、核磁共振氢谱法(1H-NMR)表征了产物的结构;应用电喷雾飞行时间质谱法(ESI-TOF-MS)、基质辅助的激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、凝胶渗透色谱法(GPC),等方法表征了产物的分子量和多分散系数;应用电位滴定法确定了产物表面伯氨基团(“-NH2”)的数量。分别合成了 PAMAM G5.0功能性化学修饰产物(PAMAM G5.0-AC80-FITC5-FA5,ND),和整合素 αυβ3 导向磷脂(DSPE-PEG2000-c[RGDyk])。应用 GPC、1H-NMR、微粒子化学发光免疫分析(CLIA)、荧光分光光度法(SPF)、紫外-可见光分光光度法(UV-Vis)、Zeta电位测定,以及透射电镜技术(TEM)等方法对ND合成产物进行了表征。应用薄层色谱法(TLC)跟踪DSPE-PEG2000-c[RGDyk]的合成反应的进程,并应用MALDI-TOF-MS法对产物分子量进行了表征。应用有机溶剂挥发法制备了功能性树状大分子/阿霉素复合物(ND/DOX),并在此基础上应用薄膜分散法制备了载阿霉素PAMAM复合脂质纳米递药系统(cRGD-PEG-PSL[ND/DOX])。以包封率(ER%)和载药量(DL%)为指标,考察并确·定了制备cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的最佳处方:ND与DOX摩尔比(1:2)、脂材浓度(29.4μmol/mL)、脂材与ND摩尔比(410:1)。同时,证明了5%(摩尔比)的c[RGDyk]-PEG2000-DSPE引入对cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的载药效果无显著影响。应用动态光散射法(DLS)、调制差示扫描量热法(DSC)、透射电镜(TEM)以及Zeta电位法对其结构进行了表征,结果表明:新制备的PAMAM复合脂质递药系统为囊泡结构,其粒径为(106.1±18.4)nm,Zeta电位为-6.00mV,且在48h内基本稳定;DOX以无定形态存在于该递药系统中,有利于阿霉素从制剂中释放。应用荧光分光光度法(SPF)考察了 cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的体外释放特性,证明其具有pH敏感性和对血浆的稳定性。在模拟人体内环境的近中性(pH=7.4)环境中,该递药系统释放药物较为缓慢,而且对血浆稳定。而在模拟肿瘤细胞组织液的弱酸性(pH=6.5)环境中,该递药系统可以将ND/DOX作为整体快速释放,从而为后者在叶酸基团的引导下继续发挥肿瘤细胞靶向性能提供前提条件。应用流式细胞术和荧光显微镜技术对空白肿瘤分级靶向PAMAM复合脂质纳米递药系统(cRGD-PEG-PSL[ND])的靶向机制进行了定性考察,结果表明:cRGD-PEG-PSL[ND]和ND表现出较高的KB细胞摄取效率;ND在KB细胞的摄取相对于HUVEC细胞具有特异性,而cRGD-PEG-PSL[ND]则表现为对KB细胞和HUVEC细胞类似的摄取效率;应用荧光光度法(SPF)对cRGD-PEG-PSL[ND]的体外入胞机制进行了定量考察,结果表明:ND在KB细胞的入胞为主动过程(需要能量),其入胞机制以网格蛋白介导的内吞途径为主,ND表面叶酸配体对其入胞效率有显著的促进作用;cRGD-PEG-PSL[ND]在KB细胞的内吞也为主动过程,其入胞机制以巨胞饮途径和以网格蛋白介导的内吞途径为主,cRGD-PEG-PSL[ND]表面c[RGDyk]配体对其入胞效率有显著的促进作用。另外,cRGD-PEG-PSL[ND]具有pH敏感性,模拟肿瘤组织的弱酸性(pH=6.5)环境能够使其释放出ND,后者可以进一步提高其在肿瘤细胞的入胞效率,避免PEG修饰对入胞的阻碍作用,同时可以有效降低由于肿瘤细胞表面整合素αυβ3(c[RGDyk]受体)的饱和对摄取效率的不良影响。应用激光共聚焦显微镜技术对cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的体外肿瘤分级靶向机制进行了考察,结果表明:在模拟人体内环境的近中性(pH=7.4)环境中,ND/DOX与cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的体外分级靶向性能相似,并明显优于其他对照制剂。然而,鉴于ND/DOX缺乏长循环效应,cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]在体内应用中的肿瘤靶向性将明显优于ND/DOX。同时,在模拟肿瘤组织的弱酸性(pH=6.5)环境中,cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]可以释放出ND/DOX,并在后者表面的叶酸配体的引导下实现KB细胞的靶向传递,其入胞效率不受c[RGDyk]配体的影响。因此该递药系统可以有效克服现有“肿瘤双重靶向机制”中普遍存在的“PEG悖论”,以及“靶细胞表面受体饱和”问题。另外,对HUVEC单细胞层TEER变化的监测结果表明,cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的肿瘤分级靶向性优势与其通过“抗新生血管作用”增加HUVEC细胞单层的通透性的能力亦密切相关,该性能也将有利于其在体内应用中的肿瘤靶向性分布。cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的体内药动学考察结果表明:该递药系统能够显著提高阿霉素的半衰期和血药浓度(t1/2≈23h),具有良好的缓释作用和长循环效应。荷瘤小鼠活体成像结果表明:cRGD-PEG-PSL[ND/DIR]的肿瘤靶向性显著较其对照制剂(MPEG-PSL[ND/DIR]和ND/DIR)增强,而且可以显著减少递药系统向重要脏器(如:肝、脾、肺、肾)的分布。cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的体外药效学考察结果表明:在模拟人体内环境的近中性(pH=7.4)环境中,该递药系统可以明显增强阿霉素的细胞毒性;而在模拟肿瘤组织的弱酸性(pH=6.5)环境中,该递药系统可以释放出其包载的ND/DOX,后者可以通过叶酸配体的靶向作用增强阿霉素的细胞毒性。建立了 S180荷瘤小鼠模型,以肿瘤体积、瘤重、体重为指标考察了 cRGD-PEG-PSL[ND/DOX]的体内肿瘤抑制率及其整体毒性。结果表明:该递药系统可以明显增强阿霉素的体内肿瘤抑制率,且能明显降低其整体毒性。空白肿瘤分级靶向PAMAM复合脂质纳米递药系统(cRGD-PEG-PSL[ND])的体外细胞毒性考察结果表明:在实验浓度范围内,cRGD-PEG-PSL[ND]对HUVEC细胞和KB细胞的细胞毒作用均较小,可以忽略。另外,cRGD-PEG-PSL[ND]的溶血性考察结果表明:该递药系统符合国家对静脉注射用液体制剂的溶血度要求,可作为血管内注射剂使用。综上所述,载阿霉素肿瘤分级靶向PAMAM复合脂质纳米递药系统(cRGD-PEG-PSL-[ND/DOX])可凭借其长循环效应、肿瘤新生血管靶向性、肿瘤细胞靶向性、肿瘤组织pH敏感释药特性,有效克服现有“肿瘤双重靶向机制”的缺陷(“PEG悖论”和“肿瘤细胞表面受体饱和降低递药系统内吞效率”),实现“先靶向肿瘤组织,再靶向肿瘤细胞”的高效肿瘤分级靶向递送。