内皮依赖性超极化因子（endothelium-derived hyperpolarizing factor, EDHF）是继一氧化氮（nitric oxide, NO）和前列环素（prostacyclin, PGI₂）之后，在血管平滑肌松弛反应过程中发现的内皮源性的第三类自体活性物质，又称非NO非PGI2血管舒张因子。EDHF在调节血管阻力、器官血流等方面起着重要作用，尤其是在酸中毒、器官缺血缺氧等病理情况下，EDHF对于恢复与维持组织器官的血供有着重要意义。文献报道在不同种属、不同部位的血管上均存在EDHF反应，脑血管中也存在EDHF反应，但其化学本质尚不清楚。本室前期实验表明在正常大鼠大脑中动脉（MCA）和脑基底动脉（CBA）的血管舒张反应中有EDHF机制参与，并且可能与内源性的硫化氢（H₂S）有关。H₂S是公认的在NO和一氧化碳（carbon monoxide，CO）之后发现的第三种气体信号分子，在机体内具有重要的生理、病理作用，参与多组织、多器官功能与代谢作用的调节。血管内皮可合成H₂S，后者引起超极化产生血管舒张作用。映山红花总黄酮（total flavones of Rhododendra flower, TFR）是从映山红花中提取的黄酮类有效部位。TFR有解痉、镇痛、抗炎等作用，本课题组发现TFR能引起正常大鼠MCA和CBA出现血管舒张反应。本研究在全脑缺血再灌（cerebralischemia-reperfusion, CIR）模型中，观察大鼠CBA和MCA中EDHF与NO介导的舒张功能的变化，探讨TFR对CIR大鼠MCA的舒张作用及其EDHF/H₂S机制。目的：1．观察乙酰胆碱（acetylcholine, ACh）诱导的CIR大鼠CBA和MCA中EDHF与NO介导的血管舒张功能的变化；2．观察TFR对CIR大鼠MCA的舒张作用及EDHF/H₂S机制；3．探讨TFR对CIR大鼠MCA平滑肌细胞钙激活钾通道的影响；4.研究TFR对CIR大鼠脑组织H₂S含量的影响。方法：1.采用改良的Pulsinelli-Brierley四血管阻断法（four-vessel occlusion，4-VO）建立大鼠全脑缺血再灌模型。2.采用动脉加压灌注法测定离体脑血管舒缩功能。观察ACh对CIR大鼠CBA和MCA的舒张作用，及在NO合酶（NOS）抑制剂N-nitro-L-arginine-methyl-ester（L-NAME,3×10-5mol/L）存在时或3×10-5mol/L L-NAME和PGI2合成酶抑制剂indomethacin（Indo,1×10-5mol/L）共同存在时，ACh对血管的舒张效应的变化；观察内源性H₂S合酶CSE的底物L-半胱氨酸（L-Cys,10-5¹0-2.5mol/L）及H₂S供体硫氢化钠（NaHS,10-5¹0-2.5mol/L）对CIR大鼠MCA的血管舒张作用；观察TFR（11²700mg/L）对CIR大鼠MCA的舒张作用，合用PGI2合成酶抑制剂Indo（1×10-5mol/L）和NOS抑制剂L-NAME（3×10-5mol/L）对TFR血管舒张反应的影响；1×10-3mol/L钙激活性钾通道（KCa）阻断剂tetraethylammonium（TEA,四乙胺）或1×10-4mol/L内源性H₂S合酶抑制剂DL-propargylglycine（PPG, DL-炔丙基甘氨酸）对TFR引起的非NO、非PGI2舒张作用的影响。3.采用细胞膜电位记录法，观察ACh对CIR大鼠CBA、MCA平滑肌细胞的超极化作用，合用L-NAME（3×10-5mol/L）和Indo（1×10-5mol/L）对血管平滑肌细胞（VSMC）超极化作用的影响；观察L-Cys（10-5¹0-2.5mol/L）及NaHS（H₂S供体,10-5¹0-2.5mol/L）对CIR大鼠MCA血管平滑肌细胞的超极化作用；观察不同浓度TFR对CIR大鼠MCA平滑肌细胞超极化作用的影响，合用L-NAME（3×10-5mol/L）与Indo（1×10-5mol/L）对TFR超极化作用的影响；研究PPG（1×10-4mol/L）或KCa阻滞剂TEA（1×10-3mol/L）对TFR诱导的非NO、非PGI2血管平滑肌细胞的超极化作用的影响。4.运用全细胞膜片钳法，记录不同浓度TFR（300²700mg/L）对急性消化分离CIR大鼠MCA平滑肌细胞钙激活的钾电流的影响及KCa阻断剂TEA（1mmol/L）对其作用的影响。5.运用免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting, MACS）分离纯化大鼠MCAs内皮细胞，采用RT-PCR技术半定量检测CIR大鼠MCAs内皮细胞中内源性H₂S合酶—CSEmRNA的表达；研究分析TFR对CIR大鼠MCA舒张作用与CSEmRNA表达的关系以及PPG对TFR的影响。6.采用全自动酶标仪测定CIR大鼠脑组织H₂S的含量以及TFR对其的影响。结果：1.在离体血管舒缩功能测定中，在30mmol/L KCl预收缩的大鼠CBA血管环上，用3×10-5mol/L L-NAME预处理后，ACh对全脑缺血再灌组（Model组）与假手术组（Sham组）的CBA均产生浓度依赖性的舒张作用，其中Model组CBA最大舒张率为61.8±5.3%，与Sham组50.3±6.1%比较，差异有显著性（P <0.01）；当合用L-NAME（3×10-5mol/L）和Ind（o10-5mol/L）预灌后，ACh仍可诱导Model组和Sham组CBA产生舒张反应，并且Model组对CIR大鼠CBA舒张反应显著高于Sham组，差异明显（P <0.01）。而加入1×10-4mol/L PPG后，ACh对CIR大鼠CBA诱导的这种非NO、非PGI2作用被显著抑制。2.在离体大鼠MCA血管环上，用L-NAME（3×10-5mol/L）预灌后，ACh对KCl（30mmol/L）预收缩的大鼠MCA仍能引发血管松弛反应，Model组与Sham组MCA最大舒张率分别为61.4±5.9%和53.0±4.0%，两者比较，差异有显著性（P<0.01）；而合用10-5mol/L Indo和3×10-5mol/L L-NAME预处理后，ACh仍可介导两组MCA产生舒张反应，其中Model组最大舒张率为59.6±5.5%，明显高于Sham组49.6±4.8%，差异有显著统计学意义（P <0.01）；且Model组MCA上的这种非NO、非PGI2效应能被PPG（1×10-4mol/L）明显抑制。3.在细胞内记录膜电位实验中，合用L-NAME（3×10-5mol/L）和Indo（1×10-5mol/L）预灌大鼠CBA后，ACh能产生浓度依赖性的非NO、非PGI2平滑肌细胞膜静息电位超极化作用，与Sham组-8.2±0.9mV相比，Model组CBA平滑肌细胞的最大超极化幅度为-10.1±1.3mV，绝对值明显加大，差异有统计学意义（P<0.05）；加入PPG（1×10-4mol/L）后，ACh对Model组CBA平滑肌细胞诱导的这种非NO、非PGI2效应几乎完全消失。4.在3×10-5mol/L L-NAME与1×10-5mol/L Indo同时存在时，ACh能诱导大鼠MCA产生浓度依赖性的非NO、非PGI2平滑肌细胞膜静息电位超极化作用，Sham组与Model组MCA的最大超极化幅度分别为-10.7±0.8mV和-12.5±1.2mV，两者比较，差异明显（P <0.05）；而1×10-4mol/L PPG能显著取消ACh对Model组MCA平滑肌细胞诱导的这种非NO、非PGI2反应。5.在运用NOS抑制剂L-NAME和PGI2合成酶抑制剂Indo，排除NO、PGI2作用后，10-5¹0-2.5mol/L内源性H₂S合酶（CSE）的底物L-Cys仍能引起CIR大鼠MCA产生显著的浓度依赖性舒张作用和VSMC膜电位的超极化作用。而应用CSE阻滞剂PPG（1×10-4mol/L）预处理后，能显著减弱L-Cys产生的非NO非PGI2效应，其最大舒张率由57.0±4.3%降至8.7±2.3%，最大超极化幅度由-10.2±1.1mV降至-1.8±0.3mV（P<0.01, vs L-Cys+L-NAME+Indo）。6.在离体血管舒缩功能测定和细胞膜电位记录实验中发现，合用3×10-5mol/LL-NAME与1×10-5mol/L Indo预处理后，外源性H₂S供体NaHS（10-5¹0-2.5mol/L）能诱导CIR大鼠MCA产生浓度依赖性的非NO非PGI2血管舒张作用和VSMC膜电位的超极化作用，其最大舒张率和最大超极化幅度分别为60.4±4.1%、-12.5±1.5mV。而1×10-3mol/L钙激活的钾通道阻滞剂TEA可明显抑制NaHS对CIR大鼠MCA的这种非NO非PGI2效应。7.在离体血管舒缩功能测定中，应用3×10-5mol/L L-NAME和1×10-5mol/LIndo预灌大鼠MCA后，在300²700mg/L范围内的TFR对30mmol/L KCl预收缩的大鼠MCA可产生浓度依赖性的非NO、非PGI2介导的舒张作用，其最大舒张率为57.8±6.6%，与溶媒组（Vehicle）比较，差异显著（P <0.01）。应用1×10-3mol/L KCa阻滞剂TEA后，TFR诱导CIR大鼠MCA产生的非NO非PGI2介导的血管舒张反应被取消，其最大舒张率降至5.7±1.2%（P<0.01, vsTFR+L-NAME+Indo）。同样，在应用内源性H₂S合酶阻滞剂PPG（1×10-4mol/L）后，PPG也显著抑制TFR对CIR大鼠MCA引起的非NO、非PGI2的血管舒张反应。8.在细胞膜电位记录实验中，TFR能诱导CIR大鼠MCA平滑肌细胞产生明显的浓度依赖性的非NO非PGI2的超极化反应，其最大超极化幅度可达-15.8±1.9mV，差异有显著统计学意义（P<0.01, vs Vehicle）。而KCa阻滞剂TEA（1×10-3mol/L）可取消TFR诱导CIR大鼠MCA产生的这种超极化作用，使其最大超极化幅度降至-0.9±0.2mV，与未用TEA组比较，差异显著（P<0.01）。1×10-4mol/L PPG也能明显取消TFR诱导产生的非NO、非PGI2超极化作用。9.在全细胞膜片钳记录VSMC钙激活性钾电流实验中，300²700mg/L TFR能促使急性分离的CIR大鼠MCA平滑肌细胞的外向电流密度呈浓度依赖性的增强（P <0.05, P <0.01, vs Control）。而此效应可以被1mmol/L钙激活的钾通道（KCa）抑制剂TEA所阻断。10.采用免疫磁珠分选法分离纯化得到大鼠MCAs内皮细胞，在RT-PCR检测实验中，发现CIR大鼠MCAs内皮细胞上有内源性H₂S合酶—CSE mRNA条带的表达；与Sham组相比，Model组内皮细胞CSEmRNA表达水平明显上调（P <0.01）；与NS组比较，TFR（50、100mg/kg）的CSEmRNA斑带亮度明显增加（P <0.01），而CSE阻断剂PPG能显著抑制TFR上调的CSEmRNA表达水平（P <0.01）。11.大鼠脑皮质H₂S含量检测结果表明Model组大鼠脑组织H₂S含量有明显升高（P <0.01, vs Sham），TFR（25、50、100mg/kg）预处理可进一步提高CIR大鼠脑组织H₂S含量（P <0.05, P <0.01, vs NS）。结论：1.在CIR大鼠CBA和MCA中，EDHF功能是上调的，NO功能是下调的，并且此EDHF反应可能是由H₂S介导的；2. TFR能诱导CIR大鼠MCA产生浓度依赖性的非NO非PGI2的血管舒张作用和VSMC超极化反应；3. TFR对CIR大鼠MCA产生的非NO非PGI2反应与KCa通道开放有关，提示这种非NO非PGI2样的效应可能为EDHF效应；4. TFR诱导的CIR大鼠MCA的EDHF反应与内源性H₂S有关；5. TFR对CIR大鼠MCA平滑肌细胞钙离子激活性钾电流有直接增强作用；6. TFR可明显提高CIR大鼠脑组织中H₂S的含量。