第一部分题目：小鼠脑外伤模型中Nrf2-ARE通路对泛素-蛋白酶体系统的作用研究背景：创伤性脑损伤(traumatic brain injury, TBI)是现代社会中引起脑部损害的主要原因,具有高致死率,高致残率的特点,给人类的生命健康带来了严重的威胁。TBI后神经元的损伤机制主要分为原发性损伤和继发性损伤,原发性损伤是外力作用时即造成的损伤,如挫裂伤、弥漫性轴突损伤等,人为干预无法改变其结果;继发性损伤是受伤之后逐渐出现的,目前发现的病理过程包括线粒体功能损伤、细胞凋亡、氧化应激、钙超载、神经毒性等,积极的处理和预防这些继发性损伤是脑外伤临床治疗的基本原则和意义所在。对于继发性脑损伤,目前尚无确实有效的治疗方法,原因在于继发性脑损伤的机制尚不明确,因此对TBI后继发性损伤机制的研究始终是国内外研究的热点,而从错综复杂的发生机制中找出关键病理通路和信号转导的核心因子是寻找有效的治疗手段的重中之重。核因子E2相关因子2(Nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)是近年来研究比较热门的一个保护因子。生理状态下,Nrf2与胞浆蛋白伴侣分子(Kelch-like ECH-associated protein1, Keap1)结合,并被Keap1传递至泛素—蛋白酶体系统进行降解,活性处于相对抑制状态。在创伤、感染等应激状态或者化学物质如tBHQ,莱菔硫烷的刺激下,Keap1结构发生变相,Nrf2与Keap1解偶联,Nrf2随即进入细胞核,与抗氧化反应元件(Antioxidant response element, ARE)结合,启动ARE调控的保护性因子的表达,提高细胞对各种刺激的抵抗力。研究表明,该通路激活后可以有效表达Ⅱ相解毒酶、抗氧化酶、抗炎症蛋白等下游分子,而这些分子恰恰涵盖了TBI后多种继发性损伤等防御性机制,如抗氧化应激、减轻炎症损伤、抗细胞凋亡等,从多个方面起到神经保护作用。泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)作为体内特异性的蛋白降解途径,以其在维持细胞及蛋白质正常功能方面的重要作用越来越受到人们重视,研究发现泛素—蛋白酶体系统受损伤后会导致异常泛素化蛋白聚集,引起细胞功能障碍甚至死亡。在阿尔茨默、帕金森、亨廷顿病等许多神经系统疾病中都已经检测到了大量泛素化蛋白的异常聚集。在颅脑外伤中有学者研究发现脑组织中泛素—蛋白酶体系统受损后导致大量异常的泛素化蛋白聚集,损害脑功能,导致神经功能的障碍：而我们在前期研究也发现外伤后人脑脊液及挫伤组织中有迅速而明显的泛素化水平的增加。这些结果均表明泛素—蛋白酶体系统是神经系统中响应损伤的一种早期反应,在TBI后继发性神经损伤发病中发挥了重要的作用,因此,对TBI后蛋白降解途径的研究具有重要意义。研究表明Nrf2的胞浆伴侣分子Keap1实质上是一种泛素—蛋白连接酶E3,Keap1与Nrf2的相互作用构成了Nrf2信号通路的调控中心。在PC12细胞系中,使用针对UPS通路的抑制剂乳胞素预处理后,可以增强氯化锰诱导的Nrf2活化,与DNA上ARE序列结合,上调一系列保护性因子的表达。这些研究结果提示,Nrf2与UPS系统之间存在密切联系。然而UPS在颅脑创伤中受何种因素调控,又作用于哪些蛋白或基因尚不清楚,本研究将对此进行探讨。目的：本实验主要目的为检测TBI后Nrf2和UPS的表达,并进一步观察在使用UPS抑制剂MG132后小鼠的预后,探讨两者之间可能的调控机制。方法：1.实验动物及分组：使用健康成年雄性ICR小鼠,大小约28-32g;成年雄性Nrf2(-/-)小鼠,大小约28-32g;均有南京军区南京总医院比较医学科提供。按随机数字表法将雄性ICR小鼠随即分为4组：对照组,外伤组,外伤+tBHQ组,外伤+MG132组；Nrf2(-/-)小鼠为外伤组,外伤+MG132组。每组动物均为12只。2.小鼠TBI模型的建立：采用改良的flierl自由落体法制备闭合性小鼠脑损伤模型。常规备皮消毒后将小鼠置于立体定向仪上,沿小鼠头部中线位置切开约1 cm,重力撞击点定位于左侧大脑半球冠状缝后3mm和矢状缝左侧3 mm的交叉点。对照组仅切开头皮,外伤组使用200 g重物自2.5 cm高处自由落体垂直撞击于定位点上。整个过程均在无菌条件下进行,并注意保持硬脑膜完整性。3.药物的处理：tBHQ先配制成浓度为5mg/ml溶于1%DMSO中的溶液,按照50mg/kg计算剂量并于造模前一天经腹腔注射给药；MG132配制成浓度为3mg/ml溶于1%DMSO的溶液,按照20mg/kg计算剂量并于造模前6小时经腹腔注射给药。4.标本的取材和制备：致伤24小时后,将小鼠麻醉后,经左心室灌注等渗盐水(4℃)至肝脏发白后断头开颅取脑。将伤灶周围1mm3的脑组织置于4%戊二醛中保存,用于电镜检测：将伤灶周围3mm的脑组织置于-80℃冰箱保存,用于western blot检测;再经同样途径灌注4%多聚甲醛,之后开颅取脑,置于4%多聚甲醛中固定,然后石蜡包埋,切片,用于免疫组织化学检测及TUNEL细胞凋亡检测。5.神经功能评分：在TBI后1天,3天采用NSS评分对小鼠进行神经功能评分。所得分值越高表示神经功能缺损越严重。6.测定脑水肿：TBI后24小时,将动物处死,迅速取脑,去除脑干及小脑,获得伤灶侧皮层组织。测定每个样品的湿重,然后在80℃烘箱中干燥72h,可获得每个样品的干重。用公式计算脑组织含水量：[(湿重—干重)／湿重]×100%。7.TUNEL细胞凋亡检测：采用TUNEL细胞凋亡试剂盒对脑组织石蜡切片(5μm)进行神经细胞凋亡对检测。同样在高倍镜视野(×400)下每张切片随即选取6个视野对TUNEL阳性细胞进行计数,求出平均值(以每100个细胞中TUNEL阳性细胞对个数来表示阳性),然后进行统计学分析。8.western blot检测：分别利用12%,10%的凝胶电泳分离核蛋白,浆蛋白,检测各组核蛋白,浆蛋白中Nrf2的表达；分别利用8%,15%凝胶电泳分离总蛋白,检测总蛋白中泛素化蛋白及游离泛素的表达。9.免疫组化染色：制作组织切片,利用免疫组化染色方法检测各组中Nrf2的表达,及Nrf2在细胞内的定位情况。10.凝胶电泳迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA):采用EMSA试剂盒对小鼠脑皮层组织进行生物素标记的Nrf2目的DNA的检测。11.乙醇磷钨酸电镜观察泛素化蛋白：外伤模型后24小时,取各组小鼠的脑组织约1mm3,置于4%戊二醛溶液中固定1小时,再分别用30%,505,70%,90%和100%乙醇梯度脱水。新鲜配制乙醇磷钨酸溶液,即10m1100%乙醇中加入O.1g磷钨酸和4滴95%乙醇。乙醇磷钨酸溶液中染色50分钟,中途换液一次。干丙酮中进一步脱水后包埋在Durcupan ACM树脂中,切成薄片后于透射电镜下观察蛋白质聚集物。12.统计学方法：采用SPSS 19.0软件进行统计分析,所有数据以均数±标准差(x±SEM)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P≤0.05为差异具有统计学意义。结果：1.TBI后激活Nrf2表达可以改善神经功能,减少脑水肿和抑制神经细胞的凋亡。与单纯外伤组相比,TBI后外伤+tBHQ组中核蛋白Nrf2明显增高(P<0.001),同时神经功能评分NSS下降(P<0.05),脑组织中水含量降低(P<0.001),神经元凋亡数目减少(P<0.001)。2.TBI激活Nrf2表达可减少异常的泛素化蛋白表达。与单纯外伤组相比,TBI后外伤+tBHQ组泛素化蛋白减少(P<0.05),相对的游离泛素增多(P<0.05)。3.TBI后抑制Nrf2表达可加剧神经功能障碍,增加脑水肿,促进神经细胞的凋亡。与单纯外伤组相比,Nrf2(-／-)小鼠在外伤后核蛋白中Nrf2表达明显降低(P<0.05),同时NSS神经功能评分升高(P<0.05),脑组织中水含量增多(P<0.05),神经元凋亡数目变多(P<0.05)。4.TBI后抑制Nrf2表达可增加异常的泛素化蛋白的表达。与单纯外伤组相比,Nrf2(-/-)小鼠在外伤后泛素化蛋白增多(P<0.05),相对的游离泛素减少(P<0.05)。5.在Nrf2(+／+)小鼠中使用MG132后可显著增加泛素化蛋白的表达,并且明显加剧神经细胞的凋亡,而在Nrf2(-/-)小鼠中使用MG132后泛素化蛋白表达没有明显改变,并且不影响神经细胞的凋亡水平。在Nrf2(+／+)小鼠中,给予MG132抑制UPS活性后(P<0.01),外伤组比对照组中神经元凋亡程度更严重(P<0.001)；在Nrf2(-/-)小鼠中,给予MG132后泛素化蛋白表达没有明显改变(P>0.05),且外伤组和对照组中神经元凋亡水平没有统计学差异(P>0.05)。结论：1.TBI后激活Nrf2表达引起泛素化蛋白的减少,表明UPS活性增高；TBI后抑制Nrf2表达引起泛素化蛋白的增加,表明UPS活性下降。2.Nrf2可能通过调控UPS来发挥神经保护作用。第二部分题目：小鼠脑外伤模型中Nrf2-ARE通路调控泛素—蛋白酶体系统的可能机制研究背景：在第一部分实验中,我们初步检测了TBI后Nrf2和UPS的表达变化,发现UPS随着Nrf2表达含量的增高而活性升高,随着Nrf2表达含量的抑制而活性下降,并且在Nrf2基因敲除小鼠身上使用UPS抑制剂后UPS活性并无显著改变。因此,我们有理由相信Nrf2可能通过调控UPS来最终发挥神经保护作用,接下来我们将进一步探讨其中可能的调控机制。有文献研究显示在使用蛋白酶抑制剂MG132后,可以观察到还原型谷胱甘肽(GSH)含量减少,伴随着高活性分子活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)的增多；同时GSH作为Nrf2-ARE下游激活的一个因子,与Nrf2之间的关系十分紧密,文献证实Nrf2-GSH通路的功能障碍直接影响Ⅱ型细胞的生长,增加对氧化剂的敏感性,从而损伤细胞。以上结果均表明,以GSH/ROS为代表的氧化还原平衡与Nrf2和UPS之间关系密切。目的：本实验通过激活或抑制Nrf2表达来检测GSH/ROS水平,同时通过激活或抑制GSH/ROS表达来检测UPS活性的高低,探讨Nrf2与UPS之间可能的调控机制。方法：1.实验动物及分组：使用健康成年雄性ICR小鼠,大小约28-32g；成年雄性Nrf2(-/-)小鼠,大小约28-32g；均有南京军区南京总医院比较医学科提供。按随机数字表法将雄性ICR小鼠随即分为4组：对照组,外伤组,外伤+tBHQ组,外伤+FAC组,外伤+NAC组；将Nrf2(-／-)小鼠分为外伤组。2.小鼠TBI模型的建立：采用改良的flierl自由落体法制备闭合性小鼠脑损伤模型。常规备皮消毒后将小鼠置于立体定向仪上,沿小鼠头部中线位置切开约1 cm,重力撞击点定位于左侧大脑半球冠状缝后3mm和矢状缝左侧3mm的交叉点。对照组仅切开头皮,外伤组使用200 g重物自2.5 cm高处自由落体垂直撞击于定位点上。整个过程均在无菌条件下进行,并注意保持硬脑膜完整性。3.药物的处理：tBHQ先配制成浓度为5mg/ml溶于1%DMSO中的溶液,按照50mg/kg计算剂量并于造模前一天经腹腔注射给药；FAC先配制成浓度为1ug/ul溶于0.9%生理盐水中,按照2.5ul／只剂量于造模前经侧脑室给药；NAC先配制成浓度为30mg/mL溶于0.9%生理盐水中,按照150mg/kg于TBI后5分钟,6小时分两次经腹腔给药。4.标本的取材和制备：致伤24小时后,将小鼠麻醉后,经左心室灌注等渗盐水(4℃)至肝脏发白后断头开颅取脑。将伤灶周围3mm的脑组织置于-80℃冰箱保存,用于GSH, ROS及western blot检测：经同样途径灌注4%多聚甲醛,之后开颅取脑,置于4%多聚甲醛中固定,然后石蜡包埋,切片,用于免疫组织化学检测；再经同样途径灌注等渗盐水(4℃)之后开颅取脑置于-800C冰箱保存,梯度蔗糖脱水后固定包埋冰冻切片,用于免疫荧光化学检测。5.检测脑组织中GSH和ROS含量：根据GSH和ROS检测试剂盒说明书进行操作,使用酶标仪进行测量,用Bradford法测定总蛋白。GSH含量和ROS强度分别用umol/L, fluorescence intensity/mg.protein来表示。6.免疫荧光化学检测：制备组织冰冻切片,利用免疫荧光双染方法检测脑组织中ROS的表达以及在神经元细胞,细胞核中的分布情况。7.western blot检测：利用8%凝胶电泳分离总蛋白,检测总蛋白中泛素化蛋白的表达。8.免疫组织化学检测：制作石蜡组织切片,利用免疫组化染色方法检测泛素化蛋白的表达。9.统计学方法：采用SPSS 19.0软件进行统计分析,所有数据以均数±标准差(x±SEM)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P≤0.05为差异具有统计学意义。结果：1.TBI后使用tBHQ可以引起GSH含量增高,ROS表达强度下降。与单纯外伤相比,TBI后使用tBHQ可以明显增高GSH表达含量(P<0.05),而且ROS表达强度明显变弱(P<0.0001)。2.TBI后Nrf2(-／-)小鼠中GSH含量降低,ROS表达强度增高。与单纯外伤组相比,TBI后Nrf2(-／-)小鼠中GSH表达含量明显降低(P<0.05),ROS表达强度明显增高(P<0.0001)。3.TBI后激活ROS表达强度后,GSH的含量显著下降,泛素化蛋白表达明显增多。与单纯外伤组相比,使用FAC刺激ROS生成后(P<0.0001),出现GSH含量的下降(P<0.05),和泛素化蛋白的增多(P<0.01)。4.TBI后抑制ROS表达强度后,GSH的含量,泛素化蛋白的表达明显减少。与单纯外伤组相比,使用NAC抑制ROS生成后(P<0.0001),出现GSH含量的升高(P<0.05),和泛素化蛋白的减少(P<0.05)。结论：1.TBI后激活表达Nrf2,可以增加GSH含量,同时减少ROS表达强度；TBI后抑制表达Nrf2,可以明显减少GSH含量,同时显著增强ROS表达强度。2.TBI后激活表达ROS,可以使GSH的含量显著下降,泛素化蛋白表达明显增多,UPS活性下降；TBI后抑制表达ROS,可以使GSH的含量显著增高,泛素化蛋白表达明显减少,UPS活性增高。3.Nrf2通过氧化还原平衡(GSH/ROS)来调控UPS的活性。第三部分题目：神经元TBI模型中Nrf2-ARE通路对泛素-蛋白酶体系统(UPS)的作用研究背景：在以上实验中,我们初步在小鼠脑外伤模型中探讨来Nrf2可能是通过调节氧化还原平衡反应进而影响UPS活性来起到神经保护作用。但是在体外环境中这条通路是否存在,还有待于进一步验证。目的：在体外环境中验证Nrf2,氧化还原平衡,UPS三者之间的关系。方法：1.神经元的培养：选取孕17-19天的成年雌性ICR及Nrf2(-/-)小鼠,断颈处死后,放入酒精中消毒。剪开腹部暴露子宫,分离胎囊。显微操作小心去除脑干,将剩余脑皮层中软脑膜,血管膜逐一清除后进行神经元的消化,并种板至6孔板中继续培养7天至神经元成熟后再行后续实验。2.神经元的分组及外伤模型：培养成熟后的ICR神经元随即分为：对照组,外伤组,外伤+tBHQ组,外伤+FAC组,外伤+NAC组；培养成熟后的Nrf2(-/-)神经元分为外伤+敲除组；神经元TBI模型采用经典的划伤模型,即使用lul枪头在六孔板中按照每隔4mm间隔划线,每个孔中约划9x9个小格子,即为神经元的外伤模型。3.药物的处理：用培养基配制tBHQ至最终浓度为10uM,于TBI前2小时加入六孔板中,每孔加入2ml；用培养基配制FAC至最终浓度为200uM,于TBI前4小时加入六孔板中,每孔加入2m1；用培养基配制NAC至最终浓度为200uM,于TBI后6小时加入六孔板中,每孔加入2ml。4. western blot检测：分别利用12%,10%的凝胶电泳分离核蛋白,浆蛋白,检测各组核蛋白,浆蛋白中Nrf2的表达；分别利用8%凝胶电泳分离总蛋白,检测总蛋白中泛素化蛋白的表达。5.实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)：按照试剂盒说明,进行目标基因Nrf2的qPCR检测。6.活性氧(reactive oxygen species, ROS)的荧光检测：按照试剂盒说明进行操作,先原位装载探针,孵育20分钟后清洗3遍,一部分进行荧光显微镜的观察,一部分进行流氏细胞仪检测测定荧光强度,使用488nm激发波长,525nm发射波长,实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。7.统计学方法：采用SPSS 19.0软件进行统计分析,所有数据以均数±标准差(x±SEM)表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,以P≤0.05为差异具有统计学意义。结果：1.神经元TBI模型后激活Nrf2的表达可以有效促进Nrf2的核转移,同时减弱ROS的表达。使用tBHQ激活Nrf2的表达,与单纯外伤组相比发现TBI后Nrf2的核转移增加(P<0.05),同时ROS的荧光强度变弱(P<0.001)。2.神经元TBI模型后抑制Nrf2的表达可以有限降低Nrf2的核转移,同时ROS的表达增强。使用Nrf2(-／-)孕鼠培养成熟的神经元中Nrf2含量显著降低(P<0.05),与单纯外伤组相比TBI后Nrf2核转移减少(P<0.001),同时ROS的表达强度明显增强(P<0.01)。3.神经元TBI模型后激活ROS的表达可以增加泛素化蛋白的表达。与单纯外伤组相比,使用FAC可以显著激活ROS的表达(P<0.01),同时发现泛素化蛋白增多(P<0.01)。4.神经元TBI模型后抑制ROS的表达可以减少泛素化蛋白的表达。与单纯外伤组相比,使用NAC可以显著抑制ROS的表达(P<0.001),同时发现泛素化蛋白减少(P<0.05)。结论：1.神经元TBI模型中激活Nr2表达可以减少ROS的表达；抑制Nr2的表达可以增加ROS的表达。2.神经元TBI模型中激活ROS表达可以降低UPS的活性；神经元TBI模型中抑制ROS表达可以增加UPS的活性。