论文部分内容阅读
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是种植最广泛的多年生豆科牧草，具有高蛋白、易于家畜消化等特点，享有“牧草之王”的美誉。虽然紫花苜蓿具有一定的抗逆能力，在轻度盐碱环境中生长良好，但是，在土壤含盐量大于0.3%、pH值大于9.5时，紫花苜蓿的生长发育明显受到抑制。因此，解析紫花苜蓿耐盐碱的分子机制对于紫花苜蓿的抗逆育种具有十分重要的意义。
本研究以耐盐碱性能优异的黑龙江省紫花苜蓿地产品种肇东苜蓿(Medicago sativa L. cv. Zhaodong)为材料，对其进行对以混合盐碱处理，利用小RNA和降解组测序，构建miRNA-靶基因调控网络；进行蛋白质组测序，结合已获得的转录组测序数据，进行转录组和蛋白质组整合分析；利用图论的方法对网络进行分析，挖掘网络中的功能子网，结合基因的注释信息，筛选处于网络中关键位置的调控基因。通过qRT-PCR，生理指标及转基因技术对关键基因进行验证。主要研究结果如下：
1.小RNA测序分析及预测的miRNA-靶基因调控网络构建
利用高通量测序技术对盐碱胁迫1天和7天的紫花苜蓿进行小RNA测序。共鉴定出149个保守的miRNA和11个新的差异表达miRNA。对差异表达miRNAs的靶基因进行分析注释。基于小RNA测序数据，分别构建了基于靶基因预测的miRNA-靶基因网络和基于靶基因预测表达负相关miRNA-靶基因网络。
24ntsiRNA主要位于基因组的重复区域，同时，这些siRNA广泛分布在转录区域上下游3kb区域中，但在转录区域及其上下游500bp的区域内分布较少。对分布数目最多的转录区域上下游1000~2000bp差异表达siRNAs所对应基因进行GO功能分析，基因的功能主要集中在氧化还原、蛋白二聚化、离子结合和调控上，推测这些基因可能在调节基因表达和抗逆过程中发挥着重要的功能。
2.降解组测序分析及基于降解组的miRNA-靶基因调控网络构建
利用高通量测序技术对盐碱胁迫1天和7天的紫花苜蓿进行降解组测序，共获得了230个盐碱胁迫下紫花苜蓿的miRNA-靶基因对。构建基于降解组测序数据的miRNA-靶基因调控网络，结果显示，所构建的网络包括353个节点，包含128个保守的miRNA，8个新的miRNA，217个靶基因。通过对此网络进行分析，在网络中共识别了31个差异表达miRNA和8个差异表达基因。GO富集分析表明，降解组靶基因注释最多的条目分别为“DNA结合”，“细胞调节过程”等。
3.蛋白组质测序及转录组与蛋白组整合分析
利用高通量测序技术对盐碱胁迫1天和7天的紫花苜蓿进行蛋白质组测序，分别在1dvs.CK、7dvs.CK和7dvs.1d中鉴定出103、1900和1922个差异表达蛋白，这些差异表达蛋白涉及到细胞内的多种功能，例如光合作用、信号转导、转运蛋白、碳水化合物代谢等。接下来将蛋白组数据与实验室前期工作所得到的转录组数据进行整合分析，在1dvs.CK、7dvs.CK组中，DEGs的数量远远高于相同时间内DEPs的数量。进一步将蛋白组与转录组的关联基因进行GO富集分析，结果表明，这些关联基因涉及到碳水化合物代谢、光合作用、信号转导、氧化还原等多种生物学功能，说明这些功能对紫花苜蓿耐盐碱胁迫至关重要。对关键蛋白进行酶活实验验证，CAT活性、SOD活性、LOX活性、几丁质酶、可溶性糖和蔗糖的含量均呈现明显上调趋势。
4.整合的盐碱胁迫调控网络的构建与分析
整合了转录组、小RNA、降解组以及蛋白组多组学的高通量测序数据，构建了多组学的紫花苜蓿盐碱胁迫调控网络。网络被划分为8个模块，并挖掘了5个候选的盐碱胁迫响应功能子网。最终从网络中预测了6个候选的miRNA和30个候选的盐碱胁迫应答关键调控基因。这些基因多数涉及氧化还原以及信号转导等生物学功能。
5.关键基因MsFTL耐盐碱功能验证
选择多组学整合筛选出的关键基因MsFTL，通过转基因烟草进行了功能验证。在MS平板上对7日龄烟草幼苗进行了6天盐碱胁迫处理，我们发现，转MsFTL基因植株的根长更长，鲜重更高。对驯化的8周龄烟草幼苗进行盐碱胁迫处理，野生型烟草叶片发生严重的萎蔫，而转MsFTL基因烟草的生长状态明显好于野生型。生理指标检测结果表明，转MsFTL基因植株中的H2O2和O2-的含量低于野生型植株，而抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性高于野生型植株。转MsFTL基因植株对盐碱胁迫具有更强的抗性。
本研究以耐盐碱性能优异的黑龙江省紫花苜蓿地产品种肇东苜蓿(Medicago sativa L. cv. Zhaodong)为材料，对其进行对以混合盐碱处理，利用小RNA和降解组测序，构建miRNA-靶基因调控网络；进行蛋白质组测序，结合已获得的转录组测序数据，进行转录组和蛋白质组整合分析；利用图论的方法对网络进行分析，挖掘网络中的功能子网，结合基因的注释信息，筛选处于网络中关键位置的调控基因。通过qRT-PCR，生理指标及转基因技术对关键基因进行验证。主要研究结果如下：
1.小RNA测序分析及预测的miRNA-靶基因调控网络构建
利用高通量测序技术对盐碱胁迫1天和7天的紫花苜蓿进行小RNA测序。共鉴定出149个保守的miRNA和11个新的差异表达miRNA。对差异表达miRNAs的靶基因进行分析注释。基于小RNA测序数据，分别构建了基于靶基因预测的miRNA-靶基因网络和基于靶基因预测表达负相关miRNA-靶基因网络。
24ntsiRNA主要位于基因组的重复区域，同时，这些siRNA广泛分布在转录区域上下游3kb区域中，但在转录区域及其上下游500bp的区域内分布较少。对分布数目最多的转录区域上下游1000~2000bp差异表达siRNAs所对应基因进行GO功能分析，基因的功能主要集中在氧化还原、蛋白二聚化、离子结合和调控上，推测这些基因可能在调节基因表达和抗逆过程中发挥着重要的功能。
2.降解组测序分析及基于降解组的miRNA-靶基因调控网络构建
利用高通量测序技术对盐碱胁迫1天和7天的紫花苜蓿进行降解组测序，共获得了230个盐碱胁迫下紫花苜蓿的miRNA-靶基因对。构建基于降解组测序数据的miRNA-靶基因调控网络，结果显示，所构建的网络包括353个节点，包含128个保守的miRNA，8个新的miRNA，217个靶基因。通过对此网络进行分析，在网络中共识别了31个差异表达miRNA和8个差异表达基因。GO富集分析表明，降解组靶基因注释最多的条目分别为“DNA结合”，“细胞调节过程”等。
3.蛋白组质测序及转录组与蛋白组整合分析
利用高通量测序技术对盐碱胁迫1天和7天的紫花苜蓿进行蛋白质组测序，分别在1dvs.CK、7dvs.CK和7dvs.1d中鉴定出103、1900和1922个差异表达蛋白，这些差异表达蛋白涉及到细胞内的多种功能，例如光合作用、信号转导、转运蛋白、碳水化合物代谢等。接下来将蛋白组数据与实验室前期工作所得到的转录组数据进行整合分析，在1dvs.CK、7dvs.CK组中，DEGs的数量远远高于相同时间内DEPs的数量。进一步将蛋白组与转录组的关联基因进行GO富集分析，结果表明，这些关联基因涉及到碳水化合物代谢、光合作用、信号转导、氧化还原等多种生物学功能，说明这些功能对紫花苜蓿耐盐碱胁迫至关重要。对关键蛋白进行酶活实验验证，CAT活性、SOD活性、LOX活性、几丁质酶、可溶性糖和蔗糖的含量均呈现明显上调趋势。
4.整合的盐碱胁迫调控网络的构建与分析
整合了转录组、小RNA、降解组以及蛋白组多组学的高通量测序数据，构建了多组学的紫花苜蓿盐碱胁迫调控网络。网络被划分为8个模块，并挖掘了5个候选的盐碱胁迫响应功能子网。最终从网络中预测了6个候选的miRNA和30个候选的盐碱胁迫应答关键调控基因。这些基因多数涉及氧化还原以及信号转导等生物学功能。
5.关键基因MsFTL耐盐碱功能验证
选择多组学整合筛选出的关键基因MsFTL，通过转基因烟草进行了功能验证。在MS平板上对7日龄烟草幼苗进行了6天盐碱胁迫处理，我们发现，转MsFTL基因植株的根长更长，鲜重更高。对驯化的8周龄烟草幼苗进行盐碱胁迫处理，野生型烟草叶片发生严重的萎蔫，而转MsFTL基因烟草的生长状态明显好于野生型。生理指标检测结果表明，转MsFTL基因植株中的H2O2和O2-的含量低于野生型植株，而抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性高于野生型植株。转MsFTL基因植株对盐碱胁迫具有更强的抗性。