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目的:1.通过体外研究金线莲多糖(AnoectochilusroxburghiiPolysaccharide,ARP)对小鼠脾淋巴细胞增殖、细胞周期、免疫相关细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α分泌及其mRNA表达的影响,探讨ARP对脾淋巴细胞的免疫调节作用及其机制。2.通过体外研究ARP对RAW264.7巨噬细胞增殖、吞噬活性、分泌NO、细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量及其mRNA表达的影响,以及对IκB p65、NF-κB蛋白表达的影响,探讨ARP对RAW264.7细胞的免疫调节作用及其机制。3.通过体内研究ARP对环磷酰胺(CTX)所致免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖、单核巨噬细胞吞噬活性、血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量及脾脏中上述细胞因子mRNA表达的影响、以及对外周血T淋巴细胞CD4+/CD8+的影响,探讨ARP对免疫抑制小鼠的免疫调节作用。4.通过体内研究ARP对脾细胞凋亡形态学变化、脾细胞周期及脾脏BcL-2、Bax、Fas、FasL mRNA表达水平的影响,探讨ARP对免疫抑制小鼠的免疫调节机理。方法:1.体外培养的小鼠脾淋巴细胞经不同浓度ARP处理。MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖水平;流式细胞仪检测细胞周期;Griess法检测NO分泌水平;ELISA 法检测细胞因子 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 的含量;RT-PCR 检测 IL-2、IL-4、IL-6、TFN-γ、THF-α-mRNA表达水平。2.体外培养的RAW264.7细胞经不同浓度ARP处理。MTT法检测RAW264.7细胞的增殖;流式细胞仪检测凋亡;中性红法检测吞噬功能;Griess法检测NO产生量;ELISA法检测细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10 的含量:qRT-PCR 检测 TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、iNOS mRNA表达水平;Western blot法检测RAW264.7细胞胞浆中IκB p65及胞核NF-κB蛋白表达。3.150只雄性昆明小鼠适应性饲养1周后,随机分为5组,分别为空白对照组、模型组及ARP低、中、高剂量组,每组30只;第1~3d,除空白对照组注射生理盐水外,其他各组腹腔注射环磷酰胺(CTX)80mg/kg,连续3d;第4~10d,空白组和模型组灌服蒸馏水,其他组分别灌服100mg/kg、200mg/kg、400mg/kgBW的ARP。末次给药24h后,称小鼠体重及胸腺、脾脏的重量,计算小鼠免疫器官指数;碳粒廓清法检测单核巨噬细胞吞噬活性;MTT法测定脾淋巴细胞增殖指数;全自动血液生化分析仪检测白细胞总数;ELISA法检测小鼠血清中细胞因子的含量;Real-time PCR技术检测小鼠脾脏中细胞因子及转录因子的表达情况;流式细胞术检测小鼠外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞百分比,以及CD4+/CD8+的比值。4.试验动物分组与处理同3。小鼠颈椎脱臼法处死后,取脾脏。HE染色法观察脾脏组织形态学变化,原位末端标记法观察脾脏细胞凋亡形态学变化,AnnexinV-FITC/PI双染法检测脾淋巴细胞凋亡情况,流式细胞仪检测脾淋巴细胞DNA周期变化,Real-time PCR法检测脾脏BcL-2、Bax、Fas、FasLmRNA 表达水平。结果:1.与脾淋巴细胞空白对照组比较,ARP组OD值升高(PP<0.05),并呈一定的量-效关系,当ARP浓度为400μg/mL时,OD值最高;ARP与ConA或LPS共同作用小鼠脾淋巴细胞时,其OD值高于ConA、LPS单独刺激组(P<0.05);ARP组Go/G1期小鼠脾淋巴细胞百分率降低(P<0.01),S期、G2/M期小鼠脾淋巴细胞百分率升高(P<0.01);ARP可促进小鼠脾淋巴细胞产生NO,当ARP浓度达到 50μg/mL 时,差异极显著(P<0.01);ARP 协同 ConA 诱导 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ分泌量明显高于ConA单独刺激组(P<0.01);ARP可提高ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞 IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、T-bet、GATA-3mRNA 表达水平(P<0.01)。2.与RAW264.7巨噬细胞空白对照组比较,ARP组OD值明显升高,当ARP浓度达到25μg/mL时,差异显著(P<0.05);ARP可降低RAW264.7细胞凋亡比率;ARP可显著提高RAW264.7细胞吞噬活性,当ARP浓度达到25μg/mL时,与细胞空白对照组比较,差异显著(P<0.05);ARP可促进RAW264.7细胞产生NO,当ARP浓度为25μg/mL时,差异极显著(P<0.01);ARP可促进RAW264.7 细胞分泌细胞因子 TNF-α、IL-lβ、IL-6、IL-l0(P<0.01),促进 TNF-α、IL-1(3、IL-6、IL-10、iNOSmRNA 表达(P<0.01);下调胞浆中 IκBp65 蛋白表达,上调胞核中NF-κB蛋白表达。3.与模型组相比,ARP高剂量组小鼠的体重增加(P<0.05);ARP组脾脏指数降低(P<0.05),胸腺指数升高(P<0.05);ARP低、中剂量组吞噬指数增加(P<0.05);ARP高剂量组T淋巴细胞增殖刺激指数(SI)增加(P<0.05);ARP高剂量组小鼠白细胞总数降低(P<0.05);ARP低、高剂量组小鼠血清中IL-2含量增加(P<0.05),高剂量组IL-6含量增加(P<0.05);ARP高剂量组小鼠IL-4mRNA相对表达量降低(P<0.05),中、高剂量组IL-6、IFN-γ相对表达量降低(P<0.05);ARP组小鼠转录因子T-bet的相对表达量降低(P<0.05),高剂量组GATA-3的相对表达量升高(P<0.05);ARP组CD4+、CD8+T淋巴细胞百分比升高(P<0.05),CD4+/CD8+降低(P<0.05)。4.CTX模型组小鼠脾小结显著缩小,生发中心不明显,淋巴细胞数量减少且结构模糊,脾白髓萎缩,红髓与边缘区界限不明显;ARP脾脏边缘区细胞数量显著增多,脾小结增大且淋巴细胞数量增多,红白髓界限明显;模型组小鼠脾细胞凋亡率为37.3%,显著高于空白对照组(P<0.05);ARP低、中、高组平均凋亡率分别为22.9%、15.7%、18.7%;模型组早期凋亡细胞比例显著高于空白对照组,ARP试验组早期凋亡细胞比例显著低于模型组,并且随着ARP浓度增加,其早期凋亡细胞比例逐渐减少;模型组脾淋巴细胞G1期细胞比例显著高于空白对照组,s期细胞比例显著低于空白对照组,经ARP处理的小鼠脾淋巴细胞sub-G1亚峰细胞比例显著降低,S期、G2细胞比例显著增高,但无剂量依赖性;与模型组相比,随着剂量增加,ARP各试验组Bax mRNA表达量逐渐减少,BcL-2 mRNA表达量逐渐增加,其Fas与FasL mRNA的表达量逐渐减少。结论:1.ARP可提高小鼠脾淋巴细胞体外免疫活性,其作用机制可能与调控细胞增殖周期,促进小鼠脾淋巴细胞体外增殖以及通过上调转录因子T-bet、GATA-3 mRNA表达水平从而促进Thl细胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-2)和Th2细胞因子(IL-4、IL-6)的分泌表达有关。2.ARP可提高RAW264.7细胞体外免疫活性,其作用机制可能与促进RAW264.7细胞增殖,降低其细胞凋亡比率,提高RAW264.7细胞吞噬活性,促进RAW264.7细胞产生NO,提高细胞因子TNF-α、11-6、IL-lβ、IL-10 的分泌水平,TNF-α IL-6、IL-lβ、IL-10、iNOS mRNA 表达水平以及促进胞浆IκBp65蛋白降解,提高胞核NF-kB蛋白的表达水平有关。3.ARP能纠正CTX引起的免疫抑制小鼠的脾脏肿大及胸腺萎缩,增强单核巨噬细胞的吞噬功能、刺激T淋巴细胞增殖、调控细胞因子的表达与分泌等,在一定程度上提高CTX引起的免疫抑制小鼠的免疫功能,并且与调节T淋巴细胞的分化有关。4.ARP能修复环磷酰胺所致小鼠脾组织病变,降低小鼠脾细胞凋亡率,促进淋巴细胞DNA复制和有丝分裂的过程,同时可以上调BcL-2/Bax的比值,下调FasmRNA表达,发挥其抑制细胞凋亡的作用。