[背景]糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy,DR）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）的微血管并发症,是导致我国工作年龄人群失明的主要原因,且其发病率还在不断上升,给人类健康和生活质量带来严重威胁。DR的发生和发展是一个错综复杂的过程,受多因素、多基因、多分子通路的影响,其具体机制尚未完全清楚。目前的研究发现,DR可能与多元醇的代谢通路异常、蛋白质非酶糖基化产物的堆积、蛋白激酶C（PKC）的活化、血管紧张素转换酶系统的作用有关,在这些传统通路的上游途径又发现了共同启动因子活性氧（Reactive oxygen species,ROS）。据报道,在DR发病机制的上游,高血糖作为起始因素导致ROS合成增加,ROS又作为一个共同启动因子瀑布式启动相关致病分子通路,而各种通路的激活又可正反馈调节ROS的合成,导致ROS合成增加,这种逐步放大的形式则导致了 DR的发生发展。因此,高糖导致的ROS合成增加是DR发病的中心环节,阻断这一中心环节可以阻断DR的发生和病理进程。视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelial,RPE）细胞由单层紧密连接的六边形细胞组成,构成了血-视网膜外屏障。RPE细胞特殊的解剖位置和功能使其易受到血糖波动的影响,发生病理和功能的改变。在DR早期,高血糖影响RPE细胞结构,损害血-视网膜外屏障,导致RPE细胞死亡、患者视力丧失。同样,高糖可以导致RPE细胞分泌异常,视网膜血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）增多,血管渗透性增加,微血管瘤和视网膜新生血管形成,最终形成DR。DR的RPE细胞损害与早期糖尿病患者的视功能下降密切相关,探究其中的具体机制有助于DR的早期诊断及治疗。细胞焦亡（pyroptosis）又称细胞炎性坏死,是由gasdermin介导的细胞程序性坏死,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。有研究发现,ROS可以诱导细胞焦亡,导致细胞膜孔隙形成、膜破裂以及IL-1β和IL-18的释放。此外,细胞焦亡标志蛋白NOD样受体家族蛋白3（NOD-like receptors,NLRP3）、cleaved-caspase-1 及 IL-1β已被报道在链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导的大鼠视网膜、糖尿病性增生性视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）患者的玻璃体中表达增加。这表明,焦亡对于DR的发展尤为重要,可能是导致视网膜细胞死亡和视网膜功能丧失的重要因素,研究DR中ROS诱导的细胞焦亡有助于帮助我们更深入的理解DR发病机制,甚至能帮助我们找到防治DR的新突破点。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的、进化高度保守的小分子非编码RNA,广泛表达于人体多种细胞,可通过介导mRNA降解和/或翻译抑制在转录后水平上负调控基因的表达,以此参与细胞增殖、分化、侵袭、迁移、凋亡、胰岛素分泌、器官形成、造血等生物学过程的调控。miR-130a已被证实在细胞增殖、凋亡、ROS产生和细胞焦亡的过程中起着重要的调控作用,但其在DR中的作用还尚未被报道。据文献报道,TNF-α/SOD1/ROS信号通路是高糖处理的MPC5足细胞中miR-130a的下游靶标,且TNF-α和SOD1均被证实参与细胞焦亡、氧化应激等过程。因此,miR-130a可能会通过调控TNF-α/SOD1/ROS信号通路来调节视网膜细胞焦亡过程,进而调节DR发展进程。基于以上背景,本研究将采用CCK-8、RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、平板克隆形成实验、DHE染色、双荧光素酶报告基因系统、HE染色、视网膜铺片等试验方法,以miR-130a为研究重点,在细胞、动物及临床三个方面,证实miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制DR的作用机制。[目的]（1）检测miR-130a在高糖诱导的视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞、DR小鼠模型以及DR患者外周血中的表达水平;（2）寻找并证实TNF-α是miR-130a的靶基因,并验证它们的靶向关系;（3）检测高糖对TNF-α和SOD1表达的影响;（4）探究高糖条件下过表达miR-130a对ARPE-19细胞增殖活力、凋亡、克隆形成能力、氧化应激、细胞焦亡的影响及机制;（5）明确过表达miR-130a对DR小鼠模型视网膜病变的影响;（6）明确miR-130a、TNF-α和SOD1在DR患者外周血中的表达及线性关系;（7）明确miR-130a表达与DR的相关性。[方法]（1）取对数生长期的ARPE-19细胞分别用正常糖（5.5 mM）和高糖（50 mM）培养0h、24 h、48 h、72 h、96 h,在高糖条件下通过慢病毒转染的方法改变ARPE-19 细胞中 miR-130a、TNF-α和 SOD1 表达;CCK-8 检测 ARPE-19 细胞增殖活;流式细胞术检测ARPE-19细胞凋亡率;平板克隆形成实验检测ARPE-19细胞克隆形成能力;DHE染色检测ARPE-19细胞中ROS水平;丙二醛（Malondialdehyde,MDA）试剂盒检测 ARPE-19 细胞中 MDA 表达;L-012 染色检测细胞外NADPH氧化酶衍生的超氧化物水平;RT-qPCR检测ARPE-19细胞中 miR-130a、TNF-α mRNA、SOD1 mRNA 表达;Western blot 检测 ARPE-19细胞中TNF-α、SOD1、增殖相关蛋白、凋亡相关蛋白、焦亡相关蛋白表达;双荧光素酶报告基因验证miR-130a和TNF-α的靶向关系。（2）通过给小鼠腹腔注射STZ诱导建立DR小鼠模型,待成模后通过慢病毒眼内注射过表达miR-130a,在第14天后检测小鼠体重和血糖变化,并处死小鼠,取出右眼,经固定、石蜡包埋后,HE染色进行组织学分析,视网膜铺片检测小鼠视网膜血管病变;取出左眼视网膜组织,采用RT-qPCR检测miR-130a、TNF-α、SOD1 的 mRNA 表达;Western blot 检测 TNF-α、SOD1、焦亡相关蛋白表达;流式细胞术检测小鼠视网膜组织中ROS水平;MDA试剂盒检测小鼠视网膜组织中MDA含量。（3）于昆明医科大学第一附属医院眼科收集3例正常人、30例糖尿病无视网膜病变（Diabetic non-retinopathy,NO DR）患者、30例DR患者外周血,将血样在8℃下以3000 g离心10 min,收集上清,RT-qPCR检测外周血中miR-130a、TNF-α mRNA、SOD1 mRNA 表达,并分析 miR-130a 与 TNF-α以及 miR-130a 与SOD1的线性关系。[结果]（1）细胞实验部分①高糖以时间依赖性显著抑制ARPE-19细胞增殖活力、促进细胞凋亡、抑制细胞克隆形成,过表达miR-130a可以缓解高糖对ARPE-19细胞增殖活力和细胞克隆形成的抑制作用,同时,过表达miR-130a也能缓解高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡。同时过表达TNF-α或敲降SOD1可恢复以上作用。②高糖以时间依赖性促进ARPE-19细胞发生氧化应激。高糖能显著上调ARPE-19细胞中ROS和MDA水平,而用ROS清除剂NAC或焦亡抑制剂NSA分别处理ARPE-19细胞后,发现NAC显著抑制高糖诱导的ROS和MDA水平,而NSA对ROS和MDA水平无显著影响,同时,过表达miR-130a显著抑制高糖诱导的ROS和MDA水平,而过表达TNF-α或敲降SOD1恢复了过表达miR-130a的该作用。③高糖可下调miR-130a的表达、上调TNF-α的表达,抑制SOD1表达。且miR-130a靶向下调TNF-α的表达。高糖抑制miR-130a和SOD1mRNA的表达,上调TNF-αmRNA表达,而过表达miR-130a恢复了高糖对miR-130a、TNF-αmRNA和SOD1 mRNA表达的作用,过表达TNF-α或敲降SOD1又可恢复过表达miR-130a的作用;双荧光素酶报告基因和Western blot检测结果显示,miR-130a靶向下调TNF-α表达。④miR-130a通过TNF-α/SOD1/ROS信号通路抑制ARPE-19细胞焦亡。高糖显著上调 TNF-α、Caspase-3、Bax、P27、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β和IL-18的表达,抑制Bcl-2和SOD 1表达,过表达miR-130a缓解了高糖对TNF-α、Caspase-3、Bax、P27、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β、IL-18、Bcl-2和SOD1表达的作用,而过表达TNF-α或敲降SOD1恢复了过表达miR-130a的作用。（2）动物实验部分:与对照组相比,DR组、DR+Ctrl-mimic组及DR+miR-130a mimic组小鼠体重显著降低,血糖浓度显著增加;DR组中miR-130a和SOD1 mRNA的表达较对照组显著降低,TNF-α mRNA表达显著增加,而DR+miR-130 a mimic部分恢复了该作用;Western blot检测结果显示,DR组中TNF-α、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β和 IL-18 的表达较对照组显著上调,SOD1表达显著下调,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用;HE染色结果显示,与对照组相比,DR组小鼠的视网膜组织中RPE层厚度降低,细胞数量减少、排列紊乱,而DR+miR-130a mimic组部分缓解了 DR组的改变;视网膜铺片结果显示,DR组小鼠血管末端可见微血管瘤及多个无灌注区,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用;流式细胞术和MDA试剂盒检测结果显示,DR组中ROS和MDA水平较Ctrl组显著增加,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用。（3）临床样本分析结果显示:DR与患者的性别、年龄、心脏病病史以及高血压病史无关,而与患者的DM病史时间显著相关。RT-qPCR检测DR患者外周血中 miR-130a、TNF-α mRNA 及 SOD1 mRNA 的表达,结果显示,miR-130a和SOD1 mRNA在NO DR患者外周血中异常低表达,在DR患者外周血中的表达更低,TNF-α mRNA在NODR患者外周血中异常高表达,在DR患者外周血中的表达更高;且miR-130a和TNF-α mRNA表达呈负相关,TNF-α mRNA与SOD1 mRNA表达呈负相关,miR-130a与SOD1 mRNA呈正相关。[结论]（1）高糖刺激可抑制ARPE-19细胞增殖活力、抗凋亡力、克隆形成能力,并促进ARPE-19细胞中氧化应激和焦亡的发生。（2）高糖可抑制ARPE-19细胞中miR-130a和SOD1表达,上调TNF-α表达,且呈时间依赖性。（3）miR-130a靶向下调TNF-α表达;（4）miR-130a通过TNF-α/SOD1/ROS信号通路抑制ARPE-19细胞焦亡（5）在STZ诱导的DR小鼠模型视网膜组织中miR-130a表达显著下调,TNF-α和SOD1表达显著上调,且过表达miR-130a可显著抑制DR模型中氧化应激和细胞焦亡;（6）DR与患者的性别、年龄、心脏病病史以及高血压病史无关,而与患者的DM病史时间显著相关。miR-130a和SOD1 mRNA在NO DR患者外周血中异常低表达,且在DR患者外周血中表达更低,TNF-α mRNA表达在NODR患者外周血中异常高表达,且在DR患者外周血中表达更高。