5-氨基乙酰丙酸(ALA)是一种非蛋白质氨基酸,是生物体合成维生素B12、血红素、叶绿素等四吡咯类化合物的前体物质。在医学领域,ALA作为癌症和肿瘤的诊断和治疗的药物引起了人们的广泛关注；在农业生产领域,ALA可用作选择特异性高、可生物降解的除草剂、杀虫剂和植物生长调节因子,具有重要的市场开发价值和应用前景。目前ALA主要使用化学合成法进行工业生产,但化学合成的反应步骤繁琐、副产物多、分离提纯复杂且得率低、环境污染严重。而生物法合成ALA以其独特的优势,如操作方便、以廉价的可再生资源为底物、环境友好等而受到广泛关注。ALA有两种生物合成的方法：一条是依赖于C4途径,添加琥珀酸和甘氨酸前体物,以类红球菌或大肠杆菌为生产菌株的生物转化法,该方法因需要添加琥珀酸和甘氨酸前体,价格比较昂贵,不适于大规模的工业化生产；另一条是本实验室构建的以C5途径为基础,以廉价的葡萄糖为唯一碳源以大肠杆菌工程菌为生产菌株的发酵合成方法。但是目前该菌株的ALA产量仍然较低,需要进一步的探索研究限制其产量的因素,从而为得到具有高产量的ALA生产菌株打下基础。本研究首先利用多种代谢工程手段改造提高ALA产量,包括寻找更加有效的ALA分泌蛋白以进一步促进产物的分泌；敲除全局转录调控因子ArcA的编码基因,解除双组份系统ArcAB在微耗氧和厌氧条件下对TCA循环的抑制作用；探究发酵过程中溶氧条件对ALA产量的影响；过表达异源的来自嗜酸性亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)的谷氨酰tRNA合成酶(GluRS,由基因gltXl和gltX编码)；过表达来自慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)的HemB抑制因子Irr等。其中敲除arcA基因对ALA产量提高作用最为显著,比对照积累量提高了43.59%。并且发现ALA的产量受溶氧水平影响,在发酵后期高的溶氧水平会引起编码谷氨酰tRNA合成酶基因gltX表达的下调,过表达异源的来自嗜酸性亚铁硫杆菌的谷氨酰tRNA合成酶基因能有效解除这种抑制作用。sRNA RyhB参与大肠杆菌的铁平衡调控,其在缺铁环境下被激活,抑制一些含铁蛋白的表达,从而减少铁的消耗。我们进一步组成型表达RyhB并分析了其对heme合成途径的调控作用及对ALA产量的影响。在E. coli DALA中组成型表达ryhB, ALA的产量提高了16%,并且heme的积累显著减少。同时,研究中发现在培养基中添加铁离子会增加heme的积累并且减少ALA的产量,而向培养基中添加铁离子螯合剂可减少heme的浓度并且增加了ALA的生产效率(ALA yield/OD600)。 qRT-PCR结果显示除了已知的RyhB的目标基因acnAB, sdhAB, fumA, cydAB的mRNA水平下降之外,hemB和hemH基因的表达也下调了。我们对RyhB序列与hemB和hemH的mRNA序列比对后分析,在hemB和hemH基因的mRNA内部可能有RyhB的作用位点,由此猜测hemB和hemH是RyhB的目标基因。尽管RyhB调节hemB和hemH的机理还没有确定,至少有三方面的原因引起了ALA产量的增加：第一,RyhB上调了ALA合成相关基因gltX的表达；第二,RyhB下调了与ALA代谢有关基因的表达；第三,heme积累量的减少解除了heme对ALA合成基因的反馈抑制作用。有文献报道heme合成过程偶联能量的生成,本研究发现过表达C5途径基因对大肠杆菌呼吸代谢产生了影响。过表达C5途径基因hemAM和hemL除了引起大肠杆菌ALA和heme的积累增加之外,还引起了乙酸、乳酸和琥珀酸积累的明显减少。为了深入分析产生这种实验现象的原因,我们利用转录组学分析,发现大肠杆菌DAL的乙酸产生和清除基因、TCA循环整体基因表达均下调了,呼吸电子传递链的组成也由总H+/e-为4的NDH-1和Cyo组成的有氧呼吸链向总H+/e-为1的NDH-2和Cyd-I组成的产能效率较低的有氧呼吸链转变。因此我们认为加强C5途径引起菌体中heme积累的增加,由于heme是大肠杆菌有氧呼吸链蛋白的辅基,heme-一方面通过其本身参与呼吸作用影响大肠杆菌的中心代谢,另一方面heme的合成过程偶联呼吸电子传递链产生能量,从而影响大肠杆菌能量产生方式以及代谢流的分配,减少乙酸、乳酸等副产物的产生,提高了碳源的利用效率。综上所述,本论文在本实验室首次构建的以C5途径合成ALA的大肠杆菌工程菌的基础上,进一步通过敲除和外源表达传统代谢工程的多种手段,结合组成型表达小RNARyhB的新策略,多方面提高工程菌的ALA产量。并且通过转录组学手段,分析过量表达C5途径基因对大肠杆菌呼吸代谢的影响的机制。这些结果为进一步提高ALA产量提供研究方向和新的思路,也为C5途径增加潜在的新应用价值。