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目的:冠状动脉壁张力升高和冠脉循环阻力上升是诱发心绞痛的重要因素。造成冠脉张力上升的因素有多种,其中血压升高是重要因素之一。升高的血压施加于管壁,使血管平滑肌张力上升,机体通过复杂的自适应机制,启动血管舒张机制,以平衡和维持冠状动脉循环的动态平衡。目前,高血压背景下冠状动脉的适应性舒张机制尚未明确。本研究选取自发性高血压大鼠(SHR)为高血压模型,应用电生理膜片钳技术和分子生物学手段,研究高血压大鼠冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)大电导钙激活电压依赖性钾离子通道(BK),以及BK通道的表达,并与正常血压组对照,阐明高血压大鼠CASMCs复极电流是否发生适应性增加,并探讨舒张机制在维持冠脉循环中的重要地位。方法:(1)、采用“三步”酶消化法,即含0.125%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)缓冲液室温孵育10分钟,酶液I消化10-20分钟,酶液II消化10-15分钟。(2)、分离大鼠冠状动脉平滑肌细胞后,应用膜片钳全细胞记录模式记录高血压和正常SD大鼠冠状动脉平滑肌细胞钾电流,分析大鼠CASMCs上主要的钾流成分及一般特性。(3)、记录并比较SHR和WKY大鼠CASMCs上BK电流以及BK尾电流的大小。(4)、提取SHR和WKY大鼠冠状动脉平滑肌细胞的RNA,并进行逆转录,利用相对定量和半定量的方法比较高血压大鼠和正常大鼠的BK通道α和β1亚基的mRNA水平。(5)、提取并纯化SHR和WKY大鼠的冠状动脉平滑肌膜蛋白,采用免疫组化和western-blot方法对高血压大鼠和正常血压大鼠BK通道α和β1亚基的蛋白水平进行比较。结果:(1)、电生理结果①WKY大鼠( n=82 )平均体重为310+13.2克,平均尾动脉收缩压为112.39+13.17mmHg, SHR(n=61)平均体重270±15.5克,平均尾动脉收缩压为172.057±20.13mmHg。SHR大鼠和WKY大鼠的平均静息电位大小分别为-31.7±4.53 mV (n =6)和-49.8±5.11 mV (n =6, P <0.05)。②SHR的平均电容为12.4±2.8pf ( n=24 ), WKY大鼠的平均电容为13.8±3.2pf(n=25),两组比较无统计学差异(p=0.117)。③在电压钳模式下,从钳制电压(Holding Potential,HP)-60毫伏(mV)逐步除极至+120mV,阶跃+10mV,维持时间400ms,刺激频率5kHz,在测试电压(Test Potential,TP)+120mv,+110mv,+100mv,+90mv下得到SHR大鼠的电流密度为(pA/pF)213.08±28.14、161.67±19.51,120.24±11.92, 84.45±10.17;WKY大鼠的相应电流密度为(pA/pF)203.82±19.53,150.31±17.26,127.39±14.70,97.54±10.37;两者比较无明显统计学差异(p>0.05)。④在0nM IBTX时,SHR大鼠(n=6)冠脉平滑肌细胞电流密度如前述,在加入100nM IBTX后相同刺激程序记录结果相应为(pA/pF)59.46±8.17,38.19±5.79,29.94±4.46,19.92±1.41,平均下降百分比为72.6%、76.8%、76.8%、78.6%,相比较有显著性差异(p<0.01);WKY(n=7)大鼠加入100nM IBTX后的各组值为(pA/pF)135.52±10.69,97.95±10.15,81.93±9.50,66.42±5.31,平均下降百分比为33.503%、34.834%、35.688%、31.868%,相比有显著差异(p<0.05)。SHR大鼠和WKY大鼠加入100nM IBTX后平均电流密度分别下降69.82±5.25%和34.32±1.87%,SHR组下降幅度是WKY组的2.03±0.62倍,具有显著差异(p<0.01),提示SHR大鼠的CASMCs上外向电流中对IBTX敏感的BK电流增大了。⑤在电极外液先加入3mM4-AP的作用下所记录到的以BK为主要成分的钾离子电流:+120mv, +110mv, +100mv, +90mv时,SHR大鼠的电流密度为(pA/pF)110.55±10.53,88.08±7.27,67.28±5.72,51.48±6.01;WKY大鼠为(pA/pF)54.65±6.11,40.45±2.91,31.29±2.11,21.31±1.93,标准化电流密度SHR组平均值同对应电压下WKY组比较高2.67±1.02倍,有显著差异(p<0.01),与100nM IBTX干预下所测结果相似。也反映了SHR大鼠的BK电流加大。⑥在尾电流研究中,实验发现,在SHR组(n=9),在+30mv, +40mv, +50mv, +60mv, +70mv, +80, +90mv时电流密度值为(pA/pF)31.37±5.61, 44.71±7.58, 62.41±6.78,71.95±9.07,86.23±9.51,97.12±10.07,113.35±11.22,WKY大鼠组(n=8)的对应值分别为(pA/pF)16.41±4.32,23.58±5.11,35.29±4.89,51.67±7.54,66.41±8.12,75.87±8.76,81.01±6.52;SHR组分别比WKY组高47.68%,47.26%,43.44%,28.15%,23.05, 21.93%, 28.54%,具有显著差异(p<0.05),这也反映了SHR大鼠的BK通道活性增加。(2)、分子生物学研究结果①通过相对定量PCR产物的溶解和扩增曲线的分析,在mRNA的表达上GAPDH> BKα> BKβ1。应用2?ΔΔCt的计算方法,得出SHR大鼠的BKβ1亚基的mRNA的表达是WKY大鼠的5.534±1.03倍,具有显著差异(n=4,p<0.05 );而SHR大鼠的BKα亚基的mRNA的表达是WKY大鼠的1.266±0.12倍,琼脂糖凝胶电泳结果与定量PCR一致。②免疫组化的结果则提示了BKα的表达在SHR表达略高,但和WKY比无明显差异; SHR大鼠BKβ1表达则升高。③Western-blot结果说明,SHR和WKY大鼠BKα亚基蛋白灰度值比为255.98±19.17:251.36±18.51,没有明显差异,而β1亚基在两组大鼠中表达均很低,SHR大鼠β1亚基同WKY大鼠之比为84.25±12.26 :29.74±5.59,具有显著性差异(p<0.05)。可见从分子生物学角度上也获得SHR大鼠的BK通道表达高于WKY大鼠,由此反映SHR大鼠冠状动脉平滑肌BK通道结构与功能改变相一致。结论:(1)大鼠冠状动脉平滑肌细胞的钾离子通道主要由BK和Kv组成,分别对IBTX和4-AP敏感。(2)SHR大鼠的心脏冠状动脉平滑肌细胞的BK通道电流明显高于WKY大鼠。(3)SHR大鼠的心脏冠状动脉平滑肌细胞的静息电位水平高于(负值变小)WKY大鼠,更趋去极化,易引起血管收缩。(4)SHR大鼠BK通道β1亚基在转录水平上高于WKY大鼠,α亚基无统计学差异。(5)SHR大鼠BK通道β1亚基蛋白表达明显升高,α亚基蛋白表达略高,但无明显差异。研究结果表明SHR大鼠冠状动脉平滑肌细胞BK通道蛋白表达增强和电流加大,标志平滑肌细胞舒张功能适应性增强,以平衡高血压时冠脉张力的上升,这种适应机制在维护高血压冠脉循环中起重要作用。