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牛冠状病毒（Bovine coronavirus,BCoV）为单股正链RNA病毒,属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus）2a亚群。BCoV可以引起新生犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道疾病,给世界养牛业造成了巨大的经济损失。牦牛是我国青藏高原牧民的重要生产生活资料。血清流行病学调查显示牦牛BCoV血清阳性率很高,但还未见牦牛BCoV的病原分子检测资料。本研究旨在调查青藏高原牦牛的BCoV感染情况及其分子特征,取得如下成果:1.成功建立了检测牛冠状病毒的RT-PCR方法我们在采用文献报道的RT-PCR方法对宏病毒组技术证实为BCoV阳性的样本进行复核时不能检出BCoV,怀疑是检测靶点序列变异或所用方法的灵敏性低所致,有必要重新建立检测BCoV的RT-PCR方法。通过分析GenBank中全部23条BCoV基因组序列,选择BCoV聚合酶基因Nsp11保守区域设计检测引物,通过反应条件和反应体系的优化,成功建立了检测BCoV的RT-PCR方法。该方法具有良好的特异性和稳定性,检测下限为3.2×103 copies·μL-1,灵敏性高。用本实验所建方法与文献引用率最高的两种检测BCoV的RT-PCR方法,同时对56份肉牛和20份牦牛腹泻粪便样本、57份肉牛和20份牦牛呼吸道鼻腔拭子进行检测,结果显示本实验所建立方法对BCoV的检出率显著高于比较的另外两种方法,本实验结果为BCoV的诊断和分子检测提供更准确的方法。2.完成了四省藏区牦牛源BCoV的分子检测和遗传进化分析为了解我国青藏高原地区牦牛源BCoV的流行情况以及进化趋势,2015年5月2018年8月,自青藏高原采集了29个牧场336份牦牛腹泻样本,其中西藏60份、青海60份、四川156份以及云南60份,并在四川藏区采集了98份患呼吸道疾病的牦牛鼻腔棉栻子。采用自行建立的RT-PCR方法对上述样本进行了BCoV检测,并挑取代表性样本同时克隆S、HE和N基因序列分析其分子特征。结果显示336份腹泻样本中BCoV的平均阳性率为69.05%,场阳性率为100%,98份患呼吸道疾病的牦牛鼻腔棉栻子中BCoV阳性率为72.45%,表明BCoV在青藏高原地区牦牛中感染普遍存在。成功地从四省藏区的40个腹泻样本中同时克隆出S、HE、N基因片段。基于S、HE和N基因片段进化分析显示大多数牦牛源BCoV毒株有独特的进化趋势,成功从四省藏区腹泻样本中获得12条完整S基因氨基酸,它们之间的核苷酸和编码的氨基酸序列同源性分别介于96.9%100.0%和95.5%100.0%,与GenBank中其他BCoV S基因全长的核苷酸及其编码的氨基酸序列同源性分别介于96.9%98.8%和95.1%98.8%,遗传进化显示本实验克隆的12条完整S基因有独特的遗传进化趋势。这是首次对青藏高原牦牛进行BCoV的病原分子检测,结果显示BCoV在牦牛中高度流行,并有独特的进化特征,对牦牛腹泻的防控有重要意义。3.成功分离到一株牦牛源BCoV并获得其完整基因组采用BCoV阳性牦牛腹泻粪便样本接种HRT-18细胞系,成功分离到一株致细胞病变的牦牛源BCoV毒株,命名为YAK/HY24/CH/2017,病毒经RT-PCR和间接免疫荧光证实为BCoV,噬斑纯化后的该毒株滴度为108.17TCID50/ml。利用Primer 6.0软件设计43对引物,成功扩增得到该毒株的完整基因组序列,该毒株的基因组长度为31032bp。基于基因组核苷酸的遗传进化树显示,YAK/HY24/CH/2017株与美国株U00735.2遗传距离最近,该毒株S基因与GenBank中所有BCoV S基因序列相比,有26个独特的氨基酸变异（S1亚基17个,S2亚基9个）,且该基因有重组事件发生其重组区域位于诱导中和抗体产生的S1B受体结合域;YAK/HY24/CH/2017株HE基因受体结合域（141283）有4个独特的氨基酸变异,且其受体结合域发生重组事件,重组区域位于182702bp,可能会影响HE基因的功能。本实验首次分离到牦牛源BCoV,并首次获得了牦牛源BCoV基因组,对进一步研究牦牛源BCoV的生物学特性以及了解BCoV的遗传进化有重要意义。