1.研究背景及目的肝豆状核变性(hepatolenticular degeneration, HLD)又称威尔逊氏病(Wilson Disease, WD)是一种常染色体隐性遗传性铜代谢紊乱导致的肝脏和神经功能受损的疾病,也是少数几种可以治疗的神经系统遗传性疾病之一。WD起病隐匿,是由于ATP7B基因突变引起的铜代谢障碍性疾病,在我国患病率高于西方国家。近年来发现WD患者的非运动障碍严重影响患者的生活质量,非运动症状包括认知功能障碍、精神障碍、睡眠障碍和自主神经功能障碍等。其中的认知功能属于人和动物中枢神经系统高级活动的范畴,海马的功能起重要作用,是学习和记忆的重要神经中枢。大量研究表明,认知功能障碍与海马神经细胞凋亡密切相关,而铜可能是诱导海马神经细胞凋亡的重要原因之一。目前主要以青霉胺(Penicillamine, PCA)为代表的金属络合剂驱铜治疗对已存在严重神经症状的WD患者往往难以奏效,究其原因,驱铜治疗虽可纠正WD铜代谢障碍引起的体内铜的正平衡,但不能终止铜诱导的脑内神经元的损伤。因此,研究WD铜诱导的神经元损伤机制及其治疗的分子靶点,是脑型WD患者的诊疗亟待解决的难题。我们通过长期大量的临床研究证实,根据通腑解毒治疗方法制成的中药复方肝豆灵对WD患者的神经和智商减退等症状有改善作用,铜是强氧化剂,能激活自由基活性.促进细胞内活性氧的产生,诱发氧化应激反应,导致神经细胞的凋亡,我们先前的实验也证实了肝豆灵具有干预铜过量负荷大鼠的学习记忆障碍的作用。Notch信号通路和海马神经细胞再生具有密切关系。Notch信号是一个高度保守的信号通路,它通过受体和配体的相互作用以及变化影响相邻细胞的分化、增殖和凋亡。既往的研究显示Notch信号转导通路具有在神经干细胞分化、血管的新生及神经元凋亡等方面的调节作用。近年来对认知、神经退行性病变的研究发现,Notch信号通路起重要作用,同时与认知关系密切的海马结构中的齿状回是成年哺乳动物脑内少数存在神经干细胞的区域之一,新的神经元可从此产生。本实验主要开展以下研究：建立铜负荷大鼠模型,观察应用通腑解毒方法制成的中药复方肝豆灵低、中、高剂量对模型鼠认知功能及Notch/Hes信号通路表达的影响,TUNEL法观察研究通腑解毒中药对铜负荷大鼠海马神经细胞凋亡的影响以及对凋亡基因Caspase-3蛋白表达的影响,初步探讨通腑解毒方法干预WD认知功能障碍的分子机制,进一步拓展通腑解毒治法在神经系统退行性疾病认知功能方面的研究应用。2方法2.1实验分为6组：分别为正常对照组、模型对照组、肝豆灵低剂量组、肝豆灵中剂量组、肝豆灵高剂量组和青霉胺组；2.2根据文献进行铜负荷大鼠模型复制；2.3使用通腑解毒方法制作的中药肝豆灵胶囊低、中、高剂量对铜负荷大鼠进行干预,选用青霉胺为阳性对照药物；2.4 Morris水迷宫法检测铜负荷大鼠认知功能；2.5光镜观察铜负荷大鼠海马区病理改变以及TUNEL法观察海马神经细胞凋亡；2.6采用免疫组化法、实时荧光定量PCR法检测Notch/Hes信号通路蛋白的表达以及海马组织的主要凋亡基因Caspase-3蛋白的表达。3.结果3.1一般情况：正常组大鼠生长状态良好,快速的体重增加,皮毛光泽度好,活动、进食状况良好。其余各组大鼠造模开始1周后出现活动显著减少,精神状态差,进食少、体重增加缓慢,甚至有下降趋势,皮毛光泽度差,部分大鼠有毛发脱落、背毛竖起、弓背、活动性减少、腹泻等。造模第3周部分大鼠开始出现明显消瘦、行走不稳,甚至出现易激惹、震颤、尖叫、攻击性等中枢神经兴奋性症状。后期少数大鼠出现肢体僵硬、乏力、甚至死亡。开始治疗后,除了模型组,其余各组大鼠的精神状况改善,饮食、饮水量明显增加。治疗6周后,各个治疗组大鼠均明显增加体重。在整个实验期间,正常对照组大鼠没有死亡。模型对照组大鼠死亡3只,各给药组在给药过程,不明原因死亡2只。3.2 Morris水迷宫认知功能实验：定位航行实验中模型对照组大鼠平均逃避潜伏期较正常对照组明显延长(P<0.01),青霉胺、肝豆灵低、中、高剂量组均较模型组平均逃避潜伏期显著减少(P<0.01)。各药物治疗组之间：肝豆灵低剂量组与中剂量组之间比较无显著差异(P>0.05),但是与高剂量组和青霉胺组比较均有显著差异(P<0.05),说明肝豆灵低中高剂量组在此试验中有相当的差异,随剂量的升高,疗效有明显提高,呈现剂量依赖性特点；而肝豆灵高剂量组与青霉胺组之间的平均逃避潜伏期比较无显著差异,(P>0.05),说明此两组对大鼠的学习记忆中的定位航行疗效相当。空间探索实验中与模型组比较,正常对照组、肝豆灵高剂量组和青霉胺组均明显增加大鼠的跨越原平台位置次数(P<0.01),而肝豆灵的低中剂量组则无明显增加,无统计学差异(P>0.05)；与正常组对照,肝豆灵高剂量组和青霉胺组的跨越原平台位置次数均无明显差异(P>0.05),而模型组和肝豆灵低中剂量组则有极显著差异(P<0.01)。与模型对照组大鼠比较,正常对照组、肝豆灵高剂量组和青霉胺组均极显著的缩短游泳总距离(P<0.01),肝豆灵的低中剂量组也有较为明显缩短(P<0.05)。从Morris水迷宫实验研究发现,肝豆灵和青霉胺可显著改善WD模型大鼠的学习记忆等认知功能,而且肝豆灵的疗效呈现剂量依赖性特点。3.3通腑解毒方肝豆灵对铜负荷大鼠海马组织病理及TUNEL细胞凋亡的影响3.3.1光镜下的海马病理形态学观察病理切片HE染色,光学显微镜下观察发现,正常对照组大鼠的海马组织神经细胞分布正常,排列整齐,以锥形细胞为主,主树突明显,细胞核大,呈圆形或椭圆形,染色深,核仁清晰。模型组海马区组织结构疏松,细胞数量减少、排列紊乱,部分细胞胞浆疏松化和空泡变性；部分区域细胞细胞缺失；少数细胞体积缩小,胞浆浓缩,核结构模糊,细胞周围出现透明环状带,呈现明显凋亡特征性改变。各治疗组与模型组相比较神经元细胞变性坏死减轻,凋亡细胞减少,细胞数较多,结构基本正常。3.3.2肝豆灵、青霉胺不同治疗组对铜负荷大鼠诱导的海马神经元凋亡的影响采用TUNEL染色检测各组的海马神经元凋亡。正常对照组的海马神经细胞罕见凋亡,模型对照组海马可见大量的棕褐色颗粒即凋亡细胞,AI与其余各组均有极显著差异(P<0.01)；肝豆灵低中高治疗组与青霉胺组也可见凋亡细胞,但较模型组明显减少,AI差异有统计学意义(P<0.01)；肝豆灵低剂量组与青霉胺组的AI差异显著(P<0.01),而高中剂量组则与青霉胺组的AI相差不大,差异无统计学意义(P>0.05)。3.4.通腑解毒中药肝豆灵对铜负荷大鼠海马组织Notch信号通路蛋白表达及神经细胞凋亡的影响3.4.1免疫组化法检测Notch-1、Hes-1蛋白表达：Notch-1、Hes-1蛋白阳性信号呈棕黄色,模型组及各治疗组可见阳性表达,模型组的平均光密度值较空白组明显减少(P<0.05),各治疗组较模型组Notch-1、Hes-1明显增加(P<0.05),青霉胺组则有极显著差异(P<0.01)。3.4.2实时荧光定量PCR检测Notch-1、Hes-1mRNA基因的相对表达：模型对照组的海马组织的Notch-1、Hes-1的基因相对表达量显著减少(P<0.01),各个中西医治疗组上调了Notch-1、Hes-1mRNA基因的相对表达,其中肝豆灵高剂量组和青霉胺组与模型对照组比较,均显著增加表达量(P<0.01)。3.4.3实时荧光定量PCR检测铜负荷大鼠模型对照组的海马组织的Caspase-3基因相对表达量显著增加(P<0.01),各个中西医治疗组的Caspase-3的基因相对表达量则有所下调,其中肝豆灵低中高剂量组、青霉胺组与模型对照组比较,均显著下调其表达量(P<0.01)。4.结论4.1本研究采用铜负荷方法复制了WD模型,模型组表现为神经认知障碍,该模型反映了铜沉积可以导致神经系统损伤,从而引起神经认知功能障碍。4.2本研究发现铜过量负荷大鼠模型可见认知功能的下降,通腑解毒中药肝豆灵对铜负荷大鼠有改善其认知功能的作用。4.3 TUNEL法观察正常对照组的海马神经细胞罕见凋亡,模型组可见大量的棕褐色颗粒即凋亡细胞,肝豆灵各剂量组与青霉胺组也可见凋亡细胞,但较模型组明显减少,凋亡指数(AI)亦明显较少,表明通腑解毒法对铜负荷大鼠海马神经细胞凋亡有干预作用,从而发挥神经保护作用。4.4免疫组化研究发现模型组Notch-1、Hes-1蛋白的阳性表达明显减少,各治疗组较模型组明显上调其蛋白的阳性表达,提示通腑解毒中药可能具有促进神经干细胞增殖分化,发挥促进神经功能恢复的作用。4.5实时荧光定量PCR发现铜过量负荷大鼠模型有Notch信号通路蛋白的阳性表达减少,各治疗组较模型组明显上调了Notch-1、Hes-1基因的相对表达,表明通腑解毒中药肝豆灵能够激活海马组织的Notch信号通路。通过激活Notch信号通路,可能调控了内源性神经干细胞增殖分化,刺激神经元的修复,进而发挥促进神经功能恢复作用。4.6实时荧光定量PCR检测对照组的海马组织的Caspase-3基因相对表达量显著增加,各个中西医治疗组Caspase-3的基因相对表达量则有所下调,表明肝豆灵各剂量组和青霉胺均能改善铜过量导致的海马神经细胞凋亡。