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目的:本课题组前期实验已证实二烯丙基二硫(DADS)可抑制DJ-1高表达胃癌细胞迁移侵袭,目前,尚没有DADS及下调DJ-1与人胃癌细胞凋亡、耐药的相关研究。此实验在人胃癌细胞SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/DJ-1上展开,研究DADS下调DJ-1能否增强SGC7901细胞凋亡与增强对5-Fu敏感性,进一步证明DJ-1是DADS增强胃癌化疗敏感性的作用靶点之一,为临床胃癌分子靶向治疗提供理论依据。方法:构建DJ-1稳定高表达的SGC7901细胞株。采用Western blot方法检测转染至SGC7901细胞中DJ-1蛋白水平。MTT检测5-Fu不同浓度的情况下,SGC7901、SGC7901+DADS、SGC7901/VCR、SGC7901/VCR+DADS、SGC7901/DJ-1、SGC7901/DJ-1+DADS细胞增殖抑制率的变化。流式细胞术检测各组凋亡率变化。qRT-PCR、Western blot与免疫荧光方法检测经DADS(30mg/L)处理前后的各组SGC7901细胞系中XIAP、Caspase-3、Bcl-2、P-gp蛋白和mRNA表达的变化。结果:1.成功构建DJ-1稳定高表达的人胃癌SGC7901细胞株。购置公司构建的DJ-1高表达慢病毒载体,将DJ-1高表达慢病毒载体转染至人胃癌SGC7901细胞系,并加入polybrene助转剂增进慢病毒的转染,转染24小时后加入0.25ug/ml的puromycin培养基,在荧光镜下观察转染的细胞,Western blot验证显示,SGC7901/DJ-1较SGC7901细胞DJ-1表达明显升高(P<0.05),表明成功构建DJ-1稳定高表达SGC7901细胞。并且,发现DADS处理SGC7901/DJ-1细胞后,DJ-1明显下调(P<0.05),说明DADS可下调DJ-1表达。2.DADS与DJ-1高表达对SGC7901细胞增殖能力的影响。MTT结果显示,在不同浓度的5-Fu作用下,经DADS作用后的各组SGC7901细胞系对照未处理的各细胞系细胞抑制率显著升高(P<0.05),各组细胞的增殖能力均明显降低。DADS处理前,DJ-1高表达组增殖抑制率的上升程度与SGC7901和耐药株SGC7901/VCR相比较前者更为显著。在5-Fu浓度为1.25mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L及20 mg/L下,SGC7901与SGC7901/VCR分别为2.2%、4.9%、16.1%、23.2%与44.6%和0.2%、0.8%、1.5%、3.1%与4.4%,较DADS处理后SGC7901与SGC7901/VCR增殖抑制率分别为4.1%、10.3%、25.1%、47.4%与58.6%和1.9%、3.5%、7.4%、20.3%与29.4%明显增加(P<0.05)。在同等浓度5-Fu的作用下,高表达DJ-1的SGC7901细胞增殖抑制率分别为1.1%、3.1%、12.1%、17.8%与35.8%,加入DADS处理过表达DJ-1的SGC7901细胞后抑制率分别为2.3%、7.4%、17.3%、30.9%与51%,可见其增殖抑制率较前者明显增加(P<0.05)。这表明DADS可以抑制SGC7901、SGC7901/VCR细胞的增殖能力,同时DADS也可以通过下调DJ-1后增强对过表达DJ-1的SGC7901/DJ-1细胞系增殖的抑制作用,并且增强对5-Fu的药物敏感性。3.DADS与DJ-1高表达对人胃癌细胞SGC7901细胞凋亡的影响。流式细胞术检测结果示:对照组SGC7901、SGC7901/VCR和SGC7901/DJ-1凋亡率分别为6.5%、1.7%和3.2%,其中SGC7901/VCR凋亡率最低,SGC7901凋亡率最高。经过DADS处理后的SGC7901、SGC7901/VCR和SGC7901/DJ-1凋亡率分别为13.9%、8.1%和10.26%,较对照组凋亡率均明显升高(P<0.05)。4.DADS与DJ-1高表达对各组SGC7901细胞蛋白表达的影响。Western blot显示,SGC-7901/DJ-1细胞中蛋白P-gp、Bcl-2、XIAP的蛋白表达比SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显上调(P<0.05)。经过DADS处理后的SGC7901、SGC7901/VCR和SGC7901/DJ-1细胞中P-gp、Bcl-2及XIAP蛋白表达较处理前下调明显(P<0.05)。DADS处理前,稳定过表达DJ-1组的SGC7901/DJ-1中Caspase-3蛋白表达较SGC7901及SGC7901/VCR细胞下调(P<0.05),DADS处理后,Caspase-3蛋白在SGC7901、SGC7901/VCR以及SGC-7901/DJ-1中较处理前上调明显(P<0.05)。qRT-PCR结果显示:与SGC7901比较,DJ-1高表达组中P-gp、Bcl-2、XIAP的mRNA表达水平明显上调(P<0.05),而Caspase-3mRNA表达明显下调(P<0.05)。经过DADS(30mg/L)处理24h后,实验组中各组细胞系P-gp、Bcl-2及XIAP mRNA表达较处理前下调明显(P<0.05),而Caspase-3 mRNA表达显著上调(P<0.05)。免疫荧光显示,在对照组中,转染DJ-1高表达的细胞中蛋白P-gp、Bcl-2、XIAP的荧光强度比SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显增加,而经过DADS(30mg/L)处理24h后,三组细胞中P-gp、Bcl-2及XIAP蛋白与相对应的未处理组相比细胞染色减弱。SGC7901/DJ-1中Caspase-3荧光表达低于SGC7901及SGC7901/VCR细胞,且SGC7901/VCR组荧光强度低于SGC7901组。经过DADS作用后,各组细胞中Caspase-3荧光表达均明显增强。结果与qRT-PCR、Western Blot结果一致。结论:1、DJ-1高表达可上调P-gp、Bcl-2、XIAP和下调Caspase-3表达,并抑制SGC7901细胞凋亡,同时降低对5-Fu的敏感性。2、DADS下调DJ-1可增强SGC7901细胞凋亡和对5-Fu的敏感性,其机制与下调P-gp、Bcl-2及XIAP和上调Caspase-3表达有关。