目的卵巢原发性恶性肿瘤中,60%～90%是上皮性癌。肿瘤细胞减灭术和以铂类为基础的化疗是上皮性卵巢癌的主要治疗原则。但随之而来的肿瘤细胞耐药问题使相当一部分患者在手术和化疗后仍会出现疾病进展或复发,致使其5年生存率不到30%,成为病死率最高的妇科恶性肿瘤。细胞凋亡受阻不但在肿瘤的发生、发展中起着重要作用;而且也是临床上肿瘤化疗失败的重要原因,成为恶性肿瘤的标志。不断理解肿瘤细胞凋亡阻滞的调节机制,通过特异性干扰肿瘤细胞中抗凋亡因子的作用,有望为肿瘤治疗新策略的建立提供基础。凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族由一类结构相关的抗凋亡蛋白组成,Livin是新近发现的一员。研究表明,Livin基因异常表达,通过调节半胱氨酸—天冬氨酸蛋白酶(caspases)-3、-7和-9可抵抗多种凋亡前体诱导的凋亡。Livin在多数恶性肿瘤如黑色素瘤及宫颈癌中表达,而在人体的大多数正常组织中不表达或低表达,提示Livin可能和其它凋亡抑制蛋白一样通过抵抗凋亡而参与了肿瘤的发生。降低或消除Livin基因在肿瘤细胞中的过度表达,可解除Livin对肿瘤细胞凋亡的抑制作用,促进肿瘤细胞死亡和增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,可能为肿瘤的治疗提供有意义的新方法。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指内源性或外源性与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA,在细胞内特异地降解该mRNA,从而致使特异性的基因有效封闭的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默。RNAi作为近年来新出现的技术以其简单快速、特异、高效、经济等特点显示出良好的应用前景。利用RNAi技术研究Livin基因在卵巢癌中的作用在国内、外未见报道。本研究利用RNAi技术研究Livin基因沉默后卵巢癌细胞增殖及凋亡的变化及对顺铂化疗敏感性的变化,以逐步增加对其在卵巢癌发生、发展中作用的认识,并藉此探讨卵巢癌基因治疗的方法和途径。本论文共分三部分。第一部分,题目:Livin及SMAC在上皮性卵巢癌中的表达及意义。目的:检测Livin及SMAC在上皮性卵巢癌组织中的表达,探讨Livin、SMAC与上皮性卵巢癌发生、发展的关系。第二部分,题目:靶向Livin-shRNA重组慢病毒载体的构建及鉴定。目的:构建靶向Livin-shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究Livin功能奠定基础,提供实验工具。第三部分,题目:Livin基因沉默对卵巢癌SKOV-3生物学功能及化疗敏感性影响的实验研究。目的:研究特异性siRNA重组慢病毒感染卵巢癌细胞SKOV-3,基因沉默后,卵巢癌细胞的增殖和凋亡的变化及对顺铂化疗敏感性的影响。方法第一部分利用RT-PCR和免疫印记(Western blotting)技术,检测20例正常卵巢组织、20例卵巢良性上皮性肿瘤和50例卵巢恶性上皮性肿瘤组织中Livin基因mRNA和蛋白的表达情况;利用免疫组化技术检测上述组织中Livin和SMAC的表达情况,并分析各自与上皮性卵巢癌临床病理参数的关系。第二部分设计并合成4个靶向Livin的短发夹状siRNA靶序列,克隆入慢病毒表达质粒pGCL-GFP;以含有Livin基因的质粒为模板,扩增Livin基因cDNA序列,克隆入真核表达载体pdsRED2-N1-3FLAG;将构建好的Livin基因过表达质粒和不同靶点的RNAi慢病毒表达质粒,经lipfectamine2000包裹,共转染入人293T细胞,Western blot和荧光显微镜检测Livin蛋白的表达情况,筛选干扰效率最高者包装成重组慢病毒;感染卵巢癌细胞SKOV-3后,实时荧光定量PCR检测Livin mRNA的变化。第三部分特异性SiRNA重组慢病毒、非特异性阴性对照慢病毒感染卵巢癌SKOV-3细胞。MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测Caspase-3的活性。再将细胞暴露于低浓度顺铂,MTT法检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测Caspase-3的活性。结果第一部分Livin在正常组织中阳性率为10%,在良性卵巢肿瘤组织中阳性率为15%,在恶性卵巢肿瘤组织中阳性率为64%,三组之间差异有统计学意义(P＜0.01)。两种异构体同时表达,表达量基本相同,蛋白水平与mRNA水平一致。Livin在卵巢恶性肿瘤中的表达明显高于其在正常卵巢组织和卵巢良性肿瘤组织中的表达。在上皮性卵巢癌组织中,Livin的表达与组织病理学分级成正相关,与分期无关;SMAC与组织病理学分级、分期成负相关,表达出现逐渐降低的趋势。第二部分挑选阳性重组克隆,经测序完全正确,成功构建针对Livin基因4个RNAi质粒和1个过表达质粒。共转染293T细胞后,2个有效靶点对Livin蛋白的表达敲减分别为75%和80%,并呈剂量依赖性。293T细胞包装出的慢病毒滴度为3×10~8TU/ml。慢病毒感染SKOV-3后,LivinmRNA的表达下降70%,其最佳感染MOI为20。第三部分MTT法检测各组细胞的吸光度值,特异性干涉组与非特异性干涉及空白对照组比较,在72h和96h时间点差异有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞仪分析LivinsiRNA对细胞干涉后72h的凋亡的影响显示,特异性干涉组细胞凋亡率为与非特异性干涉组、空白对照组的3倍(P＜0.01),非特异性干涉组与空白对照组比较没有明显差异。Western blot检测到特异性干涉组Caspase-3激活,而非特异性干涉组与空白对照组比较没有明显差异。暴露于顺铂后,联合用药组细胞的凋亡率明显增加,细胞增殖更加缓慢,Caspase-3激活显著升高。结论第一部分Livin基因mRNA和蛋白表达升高和SMAC蛋白表达降低在上皮性卵巢癌的发生、分化过程中起重要作用。Livin基因有可能成为治疗卵巢癌的靶标之一。第二部分特异性siRNA可明显抑制SKOV-3细胞中Livin基因的表达,并呈剂量和时间依赖性。成功构建了能高效抑制Livin表达的重组慢病毒,为进一步研究Livin基因的功能提供了实验工具。第三部分Livin siRNA明显地抑制SKOV-3细胞的生长活性、促进SKOV-3细胞凋亡。其抑制细胞生长、促进细胞凋亡作用可能与其抑制细胞Livin的表达,激活Caspase-3有关。特异性siRNA可以诱导卵巢癌细胞凋亡、抑制细胞增殖并增强对顺铂的化疗敏感性。