目的 1．利用同步化的Hela细胞，观察在细胞周期不同时相，哺乳动物的雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及其底物p70 S6K的α1、α2、β1、β2不同亚型及4EBP1的表达有何区别，从而阐明mTOR与细胞周期间的关系。 2．探讨mTOR及其底物在口腔鳞状细胞癌中的表达和意义。 3．研究mTOR／p70 S6K信号通路激活在腮腺腺泡细胞癌、腮腺腺癌发生中的作用。 4．研究mTOR／eIF-4EBP1信号通路激活在口腔粘液表皮样癌发生中的作用。 5．通过对口腔正常组织与混合瘤、高分化粘液表皮样癌及颊癌中M期促进因子(M-phase promoting factor，MPF)的存在状态及活性的比较，探讨MPF与口腔肿瘤的发展及恶性度之间的关系。 方法 1．Hela细胞培养及细胞周期同步化 Hela细胞(人宫颈癌传代细胞系)由日本神户大学生物信号研究中心提供。将细胞接种于含DMEM培养基的培养皿中，稀释到3.2×10~5。加入10％FBS 10ml，37℃过夜，加脱氧胸苷(TdR)，终浓度为2mM。继续培养17小时。PBS清洗两次，加新培养液，37℃9小时。加TdR，终浓度2mM，37℃15小时。再用PBS清洗两次，加新培养液，37℃分别培养4小时、8小时、10小时、12小时、16小时，依时间顺序得到各期细胞：S、G2、M1、M2、G1。 2．RT-PCR 按逆转录试剂盒使用说明操作，选用oligodT作引物合成第一链cDNA，PCR检测mTOR、p70 S6K的不同亚型α1、α2、β1、β2和4EBP1在细胞周期各时相中的表达，琼脂糖凝胶电泳溴化乙锭染色分析检测表达结果。 3．Western印迹分析 吸取上清，考马斯亮蓝法测定样品中蛋白浓度。用6%，10%，巧%SDS一PAGE电泳分离，BIORAD电泳板，双板条件为:150V，30诚。然后转移到硝酸纤维素膜上，经Zh 50V的转印后TTBS洗膜3次，每次smin。用含5%BSA的TTBS封闭，4℃过夜，再分别与抗mToR抗体(l:600)、抗p70S6K抗体(1:600)、抗4EBPI抗体(1:600)室温孵育2h，与相应的HRP标记的羊抗鼠的二抗(1:5000)室温孵育lh，ECL系统显影。 4.p70 S6K的活性测定 收集细胞，用PBS清洗细胞后在500川裂解缓冲液中裂解。裂解缓冲液成份为含有10 mM potassium phosvhate/1 mM EDTA/5 mM EGTA/10 mMMgC12/5 0 mM日一脚eerophosphate/1 mM Na3VO4/2 mM DJ，Y/40卜扩nilPMSF/0.1%NP4o。提取物用c18抗体4℃孵育30min。免疫复合物与蛋白G偶联珠反应30min后用裂解缓冲液洗两次，激酶缓冲液洗一次。清洗过后免疫复合物与含有100林M未标记ATP，200协c汀而〔，一3，P〕A，rP，125林MP70 S6K肤底物(序列:RRR此SLRA)30℃反应3Omin，加人20闪250mMEDTA，煮沸5而n，终止反应。离心后取25闪点于矶atman咫1强阳离子交换滤纸(1 Cm x Zem)上，用Beekman液闪计数仪测定epm值。 5.mTOR的活性测定 方法同4，底物为P70 S6K。 6.免疫组织化学法 对口腔鳞状细胞癌、腮腺腺泡细胞癌、腮腺腺癌组织石蜡标本进行mToR、P70 s6K、4EBPI免疫组织化学染色，观察其表达并分析其意义。结果 1 .mTOR及其底物在Hela细胞不同时相的表达 RT一PCR的结果表明:在Gl、S、G2、Ml、M2几个细胞周期时相中，mTOR的mRNA的表达无明显变化。功TOR的底物夕0肠K的亚型al、a2、日l、日2在M期表达均有明显增加。4EBPI的表达在M期明显减少。 免疫印迹的结果与RT一PCR的一致，即M期夕0 S6K的al、a2、均有增加，4EBPI在M期减少。 活性测定表明，G2期、M期mTOR较其它期有明显增加，4EBPI在M期活性有所下降。 2.mTOR及其底物在口腔鳞状细胞癌中的表达 Westem印迹的结果显示:在高分化鳞癌及低分化鳞癌中，随着肿瘤恶性度的提高，mTOR、夕0 S6K的表达明显增加，而4EBPI的表达则明显下降。RT一PCR、免疫组化与Westem印迹结果一致。 3 .mTo形夕。肠K信号通路在其它口腔肿瘤中的作用 RT一PCR、Westen印迹分析与免疫组化的结果一致:和正常组织相比，腮腺腺泡细胞癌、腮腺腺癌中夕0 S6K的表达明显增加。 4.RT一PCR与westen印迹分析的结果一致:和正常组织相比，粘液表皮样癌中mTOR的表达明显增加，4EBPI的表达明显降低。 5.MPF在口腔肿瘤及正常组织中的活性 MPF的2个亚基CdcZ及cyclinB都存在于正常口腔组织、混合瘤、高分化粘液表皮样癌及颊癌中，且肿瘤组织中的MPF量高于正常组织;肿瘤组织中的MPF的活性量高于正常组织。颊癌较正常组织高64%，提示很可能MPF的活性变化与肿瘤的恶性度有关。结论 1 .mTOR、夕0 S6K、4EPBI在Hela细胞的生长中起重要的调控作用。 2.mTOR及其底物表达水平的强弱和口腔鳞状细胞癌的分化程度密切相关，是提示肿瘤恶性程度的生物化学指标，它很可能成为未来口腔鳞状细胞癌治疗的重要靶向蛋白。， 3.夕0 S6K的表达增加可能是腮腺腺泡细胞癌、腮腺腺癌发生的主要机制之一。 4.口腔粘液表皮样癌mTOR的表达增加和4EBPI的表达明显降低可能是介导粘液表皮样癌发生的主要机制之一。 5.MPF存在于正常组织