肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常见的一种肝癌。乙肝、丙肝病毒感染或肝硬化引发的慢性炎症最终往往导致肝癌的发生。肝癌是我国癌症中的第2号杀手,每年死亡人数约占全世界死于肝癌人数的53%。凋亡的调节机制非常复杂,人们对凋亡调节基因,特别是其中的B细胞淋巴瘤／白血病基因-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2)这一基因家族进行了深入的研究。髓样细胞白血病基因-1(myeloid cell leukemia-1, Mcl-1)是Bcl-2基因家族中重要的抗凋亡成员,也是肝细胞癌中目前已知的重要抗凋亡因子,因此研究Mcl-1基因在肝癌组织中的异常表达对了解肝癌发生的可能机制及抗肿瘤治疗的可能途径有重要意义,是未来抗肿瘤治疗策略中的一个新靶点。RNA干扰技术(RNAi)是近年发展起来的新技术,RNAi引发的基因沉默作用是特异的和有效的,具有抑制作用强、稳定性高、细胞摄取相对容易等优点,为肿瘤的基因治疗提供新的、有前途的手段。是当前基因治疗研究最广为应用的基因沉默工具。小干扰RNA(siRNA)选择性抑制基因表达使基因治疗达到最大的特异性,但是弱小的细胞内导入能力、有限的血液稳定性及非特异的免疫原性阻碍了siRNA基因治疗的发展。相比普通的siRNA,具有短发卡结构的shRNA产生的RNAi效应更强,但国内外的研究都没能有效解决将siRNA导入体内细胞的转染效率低下的问题。基因转运需要合适的载体,理想的基因转运系统,应具有较高的基因转染效率、良好的靶向性和生物相容性、较高的稳定性及生物可降解性。目前的病毒载体和非病毒脂质体载体都存在不同程度的缺陷,因而寻找一种理想的基因载体就成为当务之急。纳米基因转运体的研制是目前国际纳米生物和肿瘤基因治疗研究领域重要的前沿性课题。纳米粒与DNA的连接多通过静电吸引作用来完成。DNA的磷酸骨架所带的负电荷只能与表面带正电性的载体结合。因此,需要利用生物活性分子对纳米颗粒的表面进行改性,使其表面携带阳离子物质,以起到防止纳米颗粒团聚,并有利于结合DNA分子的作用。Fe304磁性纳米粒兼具有磁靶向和被动靶向的特点,可以通过在其表面进行氨基功能化修饰,增加其稳定性和转染效率。基于以上背景和已有的研究成果,我们先用免疫化学Envision法测定抗凋亡因子Mcl-1在肝癌组织及癌旁组织中的表达,探讨凋亡机制失衡导致肝癌的发生的关系及临床病理学意义。结果显示,与高分化的肝癌组织相比,在低分化、增殖旺盛的肝癌组织中Mcl-1蛋白表达显著增强,62例肝癌组织中,Mcl-1阳性表达率为64.5%,高于临近癌旁组织,且与肝癌Edmonson grade分级、肿瘤直径、肝内外转移有关(P<0.05),为下一步的肿瘤基因治疗提供了实验基础。我们设计、合成了Mcl-1siRNA,并且与空载体质粒psiRNA-Hhlneo链接构建重组质粒Mcl-1shRNA真核表达载体psiRNA1-3,通过酶切电泳、基因测序证实是否正确构建,通过转染高表达Mcl-1的人肝癌HepG2细胞检测Mcl-1mRNA下降水平,筛选出最佳的shRNA。结果重组质粒psiRNA-Hh 1 neo-shRNA经酶切电泳、基因测序证明寡核苷酸片段成功插入预计位点,且序列与我们设计合成的完全一致,说明我们成功地构建shRNA真核表达载体psiRNA1-3。重组质粒载体转染人肝癌HepG2细胞后,HepG2细胞Mcl-1 mRNA含量较转染前及对照组均有明显的下降(P<0.01),说明我们制备的shRNA能有效抑制Mcl-1基因的表达,其中尤以psiRNA3抑制作用明显,抑制率达到58.3%。故在后续研究中,我们均以psiRNA3作为实验模板,探讨针对Mcl-1基因RNA干扰对肿瘤的治疗作用。通过改进的共沉淀法制备PLL修饰的Fe304磁性纳米粒(DMNP),用透射电镜、激光粒度分析仪考察其形态、粒径、Zeta电位,MTT法观察其细胞毒性,不同的基因／纳米粒材料比制备基因纳米复合物,通过其形态、粒径、Zeta电位、基因保护实验考察磁性基因载体的理化特性,转染pEGFP-Cl绿色荧光蛋白质粒观察基因转染效率。结果制备的葡聚糖包裹的Fe304纳米粒径均一,分散性良好。PLL修饰的氨基功能化Fe304粒径(32±4)nm, Zeta电位为+18.23mV,对基因有较好的保护作用,选此条件下制备的基因纳米复合物进行基因转染,持续作用时间较脂质体和裸基因均要长。故后续研究中以此磁性纳米基因载体进行基因治疗研究。培养人肝癌HepG2细胞后,以DMNP进行转染,并观察外加磁场作用下对基因沉默效果的影响,72h后用RT-PCR和Western Blot检测Mcl-1 mRNA和Mcl-1蛋白的抑制率,用流式细胞仪及荧光显微镜检测细胞周期的改变和细胞凋亡情况,从体外考察基因治疗效果；建立裸鼠肝癌动物模型,以基因纳米复合物作瘤内多次注射,绘制肿瘤生长曲线,24天后切取肿瘤检测瘤重抑制率,从动物在体模型考察基因治疗效果。结果发现RNA干扰治疗组在外加磁场作用下Mcl-1mRNA和蛋白质的抑制率均明显提高,分别达到72.3%和54.2%,较未加磁场作用的治疗组与阴性治疗组抑制率均显著增强(均P<0.05)。移植瘤动物实验表明RNA干扰治疗组的肿瘤生长明显减慢,较假性治疗组明显增强(P<0.01)。说明我们制备的磁性纳米基因载体(DMNP)介导的Mcl-1shRNA对Mcl-1高表达的肝细胞癌有良好的治疗效果。