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目的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染在人群中普遍存在,HCMV感染可引起患儿的神经系统及消化系统的多种疾病,已成为引起新生儿疾病和先天畸形的重要感染因素之一,但HCMV先天感染的致病机制尚不清楚。1996年,Cha TA等对HCMV实验室株AD169株、Towne株及一株命名为Toledo的低传代分离株进行了核酸序列比较,发现Toledo株在UL/b’区含有19个在AD169株不存在的新基因,分别命名为HCMV UL133、UL134、UL135...UL151,此19个基因可能在病毒的复制、潜伏和对宿主的致病性方面起重要作用。本研究以酵母双杂交系统为手段筛选与HCMV UL135蛋白相互作用人胎脑文库的蛋白因子,进而找出HCMV感染导致神经系统疾病的可能途径。该研究以这一区域片段作为诱饵蛋白,从人胎脑细胞文库中筛选与之结合的靶蛋白,为进一步深入研究HCMV的致病机制奠定基础。实验材料与方法一、实验材料标本为中国医科大学附属盛京医院病毒室保存的临床低传代分离株H；构建表达载体的相关试剂；酵母双杂交实验相关试剂；常用实验设备如BECKMAN台式低温高速离心机、Perkin Elmer PCR循环仪、电穿孔仪(BioRad)、全温振荡培养箱等；常用数据库及分析软件如基因组数据库、蛋白质分析数据库、凝胶成像及扫描分析软件、引物设计软件等。二、实验方法从感染了人巨细胞病毒的人胚肺中提取HCMV DNA,应用PCR技术以HCMV DNA为模板扩增出UL135基因的序列,将UL135扩增产物与载体pGBKT7同时进行双酶切后纯化、连接,筛选鉴定重组克隆(pGBKT7-UL135),测序并分析。应用酵母双杂交技术筛选人胎脑cDNA文库中与HCMV UL135编码蛋白相互作用的蛋白。1、提取文库质粒；2、将含有pGBKT7-UL135重组质粒转化到酵母细胞AH109中,然后再将提取的文库质粒转化到含有pGBKT7-UL135质粒的酵母细胞AH109中；3、筛选阳性克隆(显色反应及PCR技术),回转鉴定,将与HCMV-UL135相互作用的cDNA文库基因测序；4、BLAST分析。结果采用特异性引物扩增出HCMV UL135基因片段,片段长度为987bp,并成功将HCMV UL135片段克隆到酵母系统的转录结合域pGBKT7上,命名为pGBKT7-UL135。应用PCR技术鉴定含pGBKT7-UL135质粒的阳性克隆,然后提取pGBKT7-UL135质粒,用EcoR I和BamH I限制性内切酶进行酶切鉴定,测序分析显示结果与预期一致。转化文库质粒到含有pGBKT7-UL135的AH109酵母细胞中并对转化效率进行了测定,在二缺平板上长出260个克隆,计算转化效率=0.26×104cfu/μg,符合要求。做显色反应以初筛排除一些四缺培养基生长的假阳性克隆,有95个菌落呈蓝色,将其增值并提取酵母质粒。将提取的酵母质粒电转化到大肠杆菌后涂含Amp(氨苄青霉素)平板,PCR鉴定转化的菌落(用文库的上下游引物,以鉴定所转化的是否为文库信息),结果显示PCR方法鉴定出阳性克隆DNA片段大小在500bp-1500bp之间,选出阳性克隆60个,再将阳性克隆质粒回转含pGBKT7-UL135基因的酵母细胞AH109中,在二缺和四缺培养基中均生长。测序及BLAST结果分析显示有多个克隆与UL135编码蛋白相互作用,其中2个克隆与Thy-1(CD90)高度同源,其同源率达到98%。结论成功应用酵母双杂交系统筛选出与HCMV UL135编码蛋白相互作用的蛋白,其中Thy-1在HCMV感染致病过程中可能起重要作用。