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第一部分CNP与弱精子症患者精子运动功能的相关性研究[目的]检测正常人及弱精子症患者精浆中的CNP浓度,探索CNP对弱精子症患者精子活力的作用及其可能机制。[方法]本部分实验分为四部分。一、按照提前拟定的纳入排除标准,收集正常人及弱精子症患者的精液标本,对收集到的精液标本进行预处理,分离精子和精浆,运用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测精浆中的CNP浓度;精子留备后用。二、用CNP(空白对照组:Omol/L;实验组:10-6mol/L)处理弱精子症样本的精子,分别在不同时间点(第10 min、30 min、60 min、120 min、240 min)检测各组的精子活力。三、应用CNP及各种拮抗剂处理弱精子症患者的精子,处理1h后比较各实验组及空白对照组间精子活力、cGMP水平(ELISA检测)的差异。实验分组:①空白对照组;②CNP组(10-6mol/L);③8-Br-cGMP(cGMP(环磷酸鸟苷)类似物)组;④KT5823(PKG(cGMP依赖性蛋白激酶)抑制剂)组;⑤CNP+KT5823 组;⑥CNP+NPR-B拮抗剂组;⑦8-Br-cGMP+KT5823。四、运用RT-PCR技术分别检测正常人及弱精子症患者的精子CatSperl mRNA的表达水平,用CNP(空白对照组:Omol/L,;实验组:10-6mol/L)对弱精子症样本的精子进行处理,lh后分别检测CatSperl mRNA的表达水平。[结果]目前分别收集到正常精液标本47例和弱精子症精液标本45例,其精浆中CNP浓度分别为259.75±12.57pg/ml、223.04±20.91pg/ml,差异具有统计学意义(p<0.01)。用CNP(0mol/L、10-6rrmol/lL)对弱精子症样本的精子进行处理,CNP组的精子活力高于对照组,且在第60min和第120min时,差异最为明显(p<0.01)。精子处理1h后,比较各组的精子活力,CNP组与8-Br-cGMP组的精子活力均高于对照组(p<0.05)、CNP+KT5823组与NPR-B拮抗剂组的精子活力均低于CNP组(p<0.01);检测各组精子内的cGMP浓度,结果与精子活力的趋势一致,即CNP组与8-Br-cGMP组的精子内cGMP浓度均高于对照组(p<0.01)、CNP+KT5823组与NPR-B措抗剂组的精子内cGMP浓度均低于CNP组(p<0.01)。弱精子症患者的精子CatSperl mRNA表达水平低于正常人(p<0.01),用CNP(10-6mol/L)对弱精子症样本的精子处理1h后,其CatSper1 mRNA的表达水平略高于对照组,但差异无统计学意义。[结论]弱精子症患者精浆中的CNP浓度低于正常组;10-6mol/L的CNP处理精子可增加精子活力,在第60min和120min时,实验组与对照组的精子活力差异最为明显;CNP通过NPR-B/cGMP通路来增加精子的运动能力;弱精子症患者精子中的CatSper1 mRNA表达水平低于正常组,CNP对于CatSper1 mRNA表达的影响有待进一步探索。第二部分CNP对弱精子症小鼠体重和生殖系统的影响[目的]构建弱精子症动物模型,比较CNP对弱精子症小鼠体重和生殖系统的影响。[方法]应用环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)腹腔注射的方式,构建弱精子症动物模型。分组如下:①A组:空白对照(PBS);②B组:CTX(50mg/kg/d);③C组:CTX(50mg/kg/d)+CNP(25μg/kg/d);④D组:CTX(50mg/kg/d)+CNP(50μig/kg/d)。药物注射方案如下:A组小鼠连续注射10天PBS,每天一次;B组小鼠连续注射5天CTX(50mg/kg/d),然后继续注射5天PBS;C组小鼠连续注射5天CTX(50mg/kg/d),再给予连续注射CNP(25μg/kg/d)5天;D组小鼠连续注射5天CTX(50mg/kg/d),再给予连续注射CNP(50μμg/kg/d)5天。比较CNP对各组小鼠体重和生殖系统(精液质量、睾酮水平、生殖器官形态学)的影响。[结果]B组(14.48±1.78g)小鼠的体重明显低于A组(24.22±1.67g),C组(17.04±0.99g)小鼠的体重高于B组,且差异具有统计学意义。与A组(2.20土0.25mg/gb.w.)相比,B组的附辜生殖腺指数(1.45±0.38mg/gb.w.)显著降低;C组和D组的附睾生殖腺指数分别为2.03±0.34mg/gb.w.和1.87±0.29mg/gb.w.,均高于B组,差异具有统计学意义(p<0.05),而各组的睾丸生殖腺指数之间无明显差异。另外,B组的精子总活力为(18.55±3.42)%,明显低于A组((30.50±2.30)%);与B组相比,C组和D组的精子总活力分别为(31.25±8.93)%和(29.41±7.67)%,均高于B组,且具有统计学差异(p<0.05)。注射环磷酰胺后,B组((2.09±0.41)×106cells/mL/two epi.)的精子密度低于对照组((3.61±0.35)×106cells/mL/two epi.),C组((2.99±0.48)×106cells/mL/twoepi.)小鼠的精子密度高于B组(p<0.01)。与空白对照组相比,B组(仅注射CTX)的睾酮水平明显降低;C组、D组的睾酮水平均高于B组,且都具有统计学差异。HE染色显示,C组的睾丸、附睾的组织形态,与B组相比,损伤均有一定程度的改善,而精囊腺无明显差异。[结论]CNP可以在一定程度上改善弱精子症小鼠的生长状况,C组和D组的附睾生殖腺指数、精子活力均高于B组,且低浓度CNP对于缓解环磷酰胺对生殖系统损害的效应更为明显,此外,CNP对于环磷酰胺导致的睾酮浓度降低具有一定的拮抗作用。第三部分CNP调控精子运动功能的在体机制探索[目的]探索CNP在体调控精子运动功能的可能机制。[方法]本部分实验分为三部分。一、CNP对组织氧化应激水平的影响:取以上4组小鼠的睾丸进行匀浆,分别检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA);对睾丸和附睾组织进行ROS免疫荧光染色,分析CNP对组织氧化应激水平的影响。二、CNP对精子内cGMP及CatSperl表达的影响:取各组小鼠附睾中的精子,检测精子细胞内cGMP的浓度;取各组小鼠附睾头部中的精子,通过RT-PCR检测精子细胞内CatSperl mRNA的表达水平。三、CNP对免疫功能的影响:运用ELISA方法检测血清中TNF-α、IL-6的浓度;检测生殖道不同组织(睾丸、附睾)中TNF-α、IL-6的mRNA水平。[结果]与B组(CTX组)相比,C组(CTX+25μpg/kg/d CNP组)的GSH-Px、SOD、CAT水平更高,而C组的MDA水平低于B组,结果均具有统计学意义(p<0.05);D组(CTX+ 50μg/kg/d CNP组)的GSH-Px、CAT水平均高于B组,D组的MDA水平低于B组,而其SOD水平与B组无明显差异。免疫荧光显示,C组和D组的睾丸组织ROS浓度低于B组,各组附睾组织的ROS水平无明显差异。C组和D组附睾精子的cGMP水平均高于B组,差异具有统计学意义;C组和D组精子细胞内CatSper1 mRNA水平高于B组,但差异无统计学意义。与A组相比,B组小鼠血清中的TNF-α、IL-6水平升高,而C组小鼠血清中的TNF-α、IL-6水平低于B组。B组睾丸、附睾中的TNF-α mRNA水平均高于A组,C组睾丸、附睾中的TNF-α mRNA水平均低于B组;B组睾丸、附睾中的IL-6 mRNA水平均高于A组,C组睾丸、附睾中的IL-6 mRNA水平均低于B组;D组附睾中的IL-6 mRNA水平均低于B组。[结论]CNP可通过增加附睾精子细胞内的cGMP水平来调节精子的运动功能;CNP还可能通过改善组织氧化应激水平、降低TNF-α和IL-6等免疫因子的表达,从而影响精子运动。