第一部分肝癌相关重组腺相关病毒载体的构建及在肝癌树突状细胞疫苗免疫治疗研究中的应用 目的:利用携带甲胎蛋白(α—fetoprotein，AFP)基因的重组腺相关病毒(recombinantadeno—associatedvirus，rAAV)转染树突状细胞(dendriticcell，DC)体外诱导抗肝癌免疫应答。并通过构建肝癌细胞特异性rAAV，将IFN—γ基因导入肝癌细胞进一步增强rAAV/AFP—DC疫苗诱导的抗肝癌免疫应答。 方法: 1.携带IFN—γ基因的肝癌细胞特异性rAAV(rAAV/IFN—γ)的构建：PCR扩增甲胎蛋白启动子(AFPpromoter，AFPp)、白蛋白启动子(Albuminpromoter，ALBp)和巨细胞病毒增强子(cytomegalovirusenhancer，CMVe)、β—actin增强子(β—actinenhancer，βe)，并按不同的组合插入到rAAV载体中。将含有不同启动子和增强子的rAAV分别转染肝癌细胞株HepG2和Hep3B，筛选出表达活性最强的rAAV。利用筛选出的rAAV转染其他非肝癌细胞株，验证rAAV的肝癌组织特异性。将IFN—γ基因插入到肝癌细胞特异性rAAV载体中，利用rAAV/IFN—γ转染HepG2和Hep3B，检测IFN—γ的表达水平及对HLA—classⅠ分子表达的影响。 2.rAAv/AFP—DC体外诱导抗肝癌免疫应答：利用rAAV/AFP转染来源于HLA—A2阳性健康志愿者的DC制备肝癌疫苗，检测rAAV/AFP—DC疫苗的表型、AFP表达及细胞因子分泌。rAAV/AFP—DC疫苗体外刺激自体T淋巴细胞，观察对T细胞亚群和细胞因子分泌的影响。细胞毒实验检测并比较活化的T细胞对肝癌细胞株和rAAV/IFN—γ转染肝癌细胞株的杀伤作用。 结果: 1.结果表明rAAV/ALBp在Hep3B中表达活性最强，而rAAV/CMVeAFPp在HepG2中的表达活性最强，并且这两种病毒在其他所有检测的非肝癌细胞株中均没有表达活性。rAAV/ALBp/IFN—γ和rAAV/CMVeAFPp/IFN—γ分别转染Hep3B和HepG2后，两种细胞均能有效表达IFN—γ，并且HLA—classⅠ分子表达水平显著上调。 2.rAAV/AFP—DC能够有效表达AFP，表面分子CD80、CD83、CD86、CD40、HLA—DR、CD1a表达上调，并大量分泌IL-12。rAAV/AFP—DC疫苗体外刺激自体T淋巴细胞大量增殖，检测发现增殖的T细胞主要为CD8+CD69+活化的杀伤性T细胞(cytotoxicTlymphocyte，CTL)，而CD4+CD25+的调节性T细胞(regulativeTcell，Treg)则较少，并且活化的T细胞大量分泌IFN—γ，而不分泌IL—4。CTL对Hep3B和HepG2均有不同程度的杀伤作用，并且rAAV/IFN—γ转染肝癌细胞后，CTL对肝癌细胞的杀伤作用增强。 结论: 筛选出的两种肝癌细胞特异性rAAV具有相对的肝癌组织特异性，为肝癌的治疗提供了一种靶向性的载体工具。rAAv/AFP—DC疫苗体外能够诱导出有效的抗肝癌免疫应答。rAAV/IFN—γ转染肝癌细胞后，能够增强CTL对肝癌细胞的杀伤作用，从而建立了一种增强DC疫苗诱导的抗肝癌免疫应答的新方法，为研究出更有效、更特异的抗肝癌免疫疗法奠定了基础。 第二部分病人肿瘤组织来源肾癌细胞与异体树突状细胞融合疫苗诱导抗肿瘤免疫：体外实验结果与临床反应 目的：肾细胞癌(renalcellcarcinoma，RCC)已经被证明对免疫治疗比较敏感，本研究旨在探讨病人肿瘤组织来源肾癌细胞与异体树突状细胞(dendriticcells，DC)融合疫苗诱导抗肾癌免疫反应。 方法: 将10例HLA—A2阳性肾癌病人的原代肾癌细胞与来源于HLA—A2阳性健康志愿者的DC融合。通过流式细胞仪和共聚焦显微镜检测融合细胞的表型。在体外实验中，用异体DC/RCC融合细胞刺激自体T淋巴细胞，检测T细胞的增殖、IFN—γ分泌及杀伤性T细胞(cytotoxicTlymphocytes，CTL)活性。在临床试验中，10例病人分别免疫接种异体DC/RCC融合细胞疫苗，观察副作用和毒性，并通过CT扫描来评估临床反应。 结果: 融合细胞同时表达肿瘤相关抗原和DC表面分子。在体外实验中，融合细胞能够刺激自体T细胞大量增殖并分泌IFN—γ，同时诱导强烈的抗肾癌细胞CTL反应。在体内试验中，免疫接种没有产生严重的副作用、毒性及自身免疫反应，而病人外周血中T细胞亚群的比例显著增加。在10例病人中，有1例病人出现部分缓解(PR)，其肺转移瘤明显缩小。另外有6例病人病情稳定(SD)(随访1.5年)。 结论: 异体DC/RCC融合细胞疫苗体外能够诱导有效的抗肾癌免疫应答。免疫接种后，部分病人出现PR和SD反应，并不伴有严重的毒性和副作用，表明该方法是安全的，并且能够在部分病人体内诱导抗肿瘤免疫反应，有望成为肾癌免疫治疗的新方法。