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海洋来源的天然活性产物为抗肿瘤新药的研究与开发提供了大量的母核结构和药物前体,对海洋天然产物的抗肿瘤活性及分子机制进行深入探究,是我们开发海洋创新药物的重要基础和前提条件。Libertellenone H（LH）是来自于北极真菌Eutypella sp.D-1的海松烷型二萜化合物,在本课题组前期活性实验中表现出显著的抗肿瘤活性,对多株肿瘤细胞具有增殖抑制效应。本研究拟通过检测LH对胰腺癌细胞的抗肿瘤活性,探究LH抗肿瘤活性的分子机制及作用靶标,为LH的进一步开发奠定基础。第一章,我们首先采用优化后的发酵条件对北极真菌Eutypella sp.D-1进行大规模发酵,得到发酵物浸膏后对LH进行分离纯化,最后共分离得到153 mg LH化合物单体用于后续的体内外活性实验。接下来,我们进行了细胞生物学功能实验检测,结果显示LH对四株人胰腺癌细胞株均表现出显著的抑制活性,在PANC-1和SW1990中还可以抑制细胞克隆形成和细胞侵袭、阻滞细胞周期并促进细胞凋亡。为阐明LH抗肿瘤活性的分子机制,我们通过人基因表达谱芯片,筛选了LH作用前后表达具有显著性差异的基因,共得到57个上调基因以及90个下调基因。对差异基因进行IPA分析提示LH可能调控胆固醇生物合成和NRF2介导的氧化应激等通路,在疾病的发生和死亡、结缔组织发育和脂质浓度等疾病和功能中发挥作用。第二章,我们着重讨论了LH抗肿瘤作用的分子机制。由芯片结果提示LH可激活肿瘤细胞氧化应激,我们证实了LH可诱导肿瘤细胞中ROS水平迅速升高并长时间维持在较高水平,同时还伴随着抗氧化剂还原性GSH水平的降低;使用ROS清除剂NAC和抗氧化酶SOD预处理肿瘤细胞,可以一定程度上逆转LH诱导的肿瘤细胞ROS堆积、细胞凋亡和增殖抑制,表明过量的活性氧堆积是LH抗肿瘤效应的基础。为探究LH如何打破肿瘤细胞氧化还原失衡,我们通过酶活性实验和细胞实验检测了LH对抗氧化酶系统Trx系统的抑制作用,LH在体外酶学实验及细胞水平上均显示对Trx系统具有显著的抑制效果,而对同样含有巯基的Grx和GR酶活性影响较弱,说明LH可选择性抑制Trx/Trx R;同时,肿瘤细胞中Trx下游与凋亡相关的ASK1/JNK信号级联通路可被LH激活;为探究Trx系统在LH抗肿瘤活性中的作用,我们使用si RNA降低细胞中Trx R的表达,结果LH诱导的生长抑制作用也相应降低,表明Trx R参与了LH所诱导的肿瘤细胞生长抑制。为探究LH对Trx系统的抑制作用,我们通过分子对接模拟,LC-MS/MS验证了LH与Trx1及Trx R蛋白的结合,结果表明LH中的α,β不饱和羰基可以与Trx1蛋白活性位点Cys32/Cys35残基中游离的巯基以及Trx R C端氧化还原活性位点Sec498残基中游离的硒醇发生迈克尔加成反应,形成共价结合。BIAM实验也证实了LH与Trx R活性位点Sec498的结合。第三章,主要探究了LH在抵抗肿瘤耐药上的潜力。我们将单个的SW1990肿瘤细胞在3D软纤维凝胶蛋白中培养,可生长得到多细胞近球状的SW1990-TRCs肿瘤球克隆;q PCR检测相关干性基因的表达,结果显示与普通培养的SW1990细胞相比,SW1990-TRCs中胰腺癌标志物CD133、CD44、Tspan8和自我更新基因Sox2的表达量更高,说明3D软纤维凝胶蛋白培养得到的SW1990-TRCs具有一定的干细胞特征,可用于体外探究LH抵抗耐药肿瘤细胞的作用。LH对SW1990-TRCs克隆表现出显著的生长抑制作用:第0天给药时IC50为8.32μM,20μM LH处理可以使SW1990-TRC克隆停止增长;另外,LH对SW1990-TRCs克隆的生长抑制还具有持久性,将LH洗脱后对肿瘤克隆的生长抑制依然存在;DAPI/PI染色结果显示LH可以显著促进SW1990-TRCs细胞凋亡,但LH抑制SW1990-TRCs的具体分子机制仍需进一步深入探究。