背景：自噬在缺血性心血管疾病中的作用研究已经成为一个新的热点。研究表明，心肌细胞在营养和能量缺乏、氧化应激、蛋白质大量聚集等应激状态下，自噬可以被激活。一方面，通过自噬，细胞可以在病理条件下延长存活时间;另一方面，过度激活的自噬可能引起细胞发生凋亡。目前，自噬与凋亡的关系并不十分清楚。已知的是，自噬与凋亡是两个动态变化的事件，它们通过内在的分子机制相互影响、相互转化，二者的动态平衡或失衡决定了细胞的生存或死亡。因此阐明自噬和凋亡的动态关系对细胞命运转归的作用机制具有重要意义，也有助于寻找治疗心肌缺血性疾病的有效措施。　　心肌缺血在中医范畴属于冠脉瘀阻，脏器失养。具有益气活血功效的中药或有效成分对缺血、缺氧的心肌具有保护作用已经得到证实。机制包括扩张冠脉、改善心肌代谢、促进血管新生、抑制细胞内Ca2+超载、抑制凋亡等。而干预心肌细胞的自噬作用可能是中药治疗心肌缺血的机制之一，但是其对自噬的调节作用研究结果尚不一致，机制也不明确。这可能与没有重视“自噬和凋亡是两个动态变化的过程”有关。单一时间点的研究不能全面的反应自噬和凋亡在病理状态下的动态变化，更不能反应二者的动态变化如何影响细胞命运转归，因而也不能全面反应中药对自噬和凋亡相互作用动态变化的调节作用。所以，连续的观察中药、自噬、凋亡三者的动态关系对阐明药物的作用和机制是十分必要的。　　目的：动态观察心肌细胞在持续营养缺乏状态下，自噬与凋亡的变化趋势，阐释自噬与凋亡相互作用的规律;通过动态观察益气药有效成分对营养缺乏心肌细胞自噬、凋亡及自噬与凋亡的相互作用相关指标的影响，阐明药物调节营养缺乏心肌细胞自噬与凋亡的作用机制。为完善益气药临床治疗缺血性心血管疾病的作用机制提供理论依据。　　方法：　　第一部分、营养缺乏诱导的心肌细胞自噬与凋亡的变化趋势及相互关系　　1.持续营养缺乏诱导的大鼠心肌细胞自噬与凋亡的变化趋势建立H9c2心肌细胞持续营养缺乏（将正常培养液换为无糖无血清培养液）0，30，60，90，120，150，180，210，240，270，300，330，360min模型。筛选出细胞活力变化呈现较强时间依赖性的时间点。在筛选出的时间点提取细胞蛋白，Westernblot检测自噬及凋亡相关蛋白表达水平，观察自噬与凋亡的变化趋势。　　2.营养缺乏诱导的心肌细胞自噬与凋亡的相互关系根据实验1结果，在自噬水平最高时间点使用自噬抑制剂和自噬促进剂处理细胞。Westernblot检测两种处理条件下凋亡蛋白的表达水平，观察自噬与凋亡的相互关系。　　第二部分、人参皂苷Rg1对持续营养缺乏心肌细胞自噬与凋亡的影响　　1.人参3种有效成分对持续营养缺乏心肌细胞的药效作用筛选根据第一部分实验1结果选择自噬水平最高时间点建立H9c2细胞营养缺乏模型，MTT法、Westernblot分别考察益气药有效成分对细胞活力、自噬蛋白、凋亡蛋白表达量的影响，筛选最佳中药有效成分。　　2.人参皂苷Rg1对持续营养缺乏诱导的心肌细胞凋亡的影响用最佳药效中药有效成分处理营养缺乏0-240min细胞。连续多时间点MTT法检测细胞活力;Westernblot检测细胞凋亡蛋白;流式细胞术、TUNEL法检测细胞凋亡率。　　3.人参皂苷Rg1对持续营养缺乏诱导的心肌细胞自噬的影响检测凋亡水平同时进行自噬检测:Westernblot检测细胞自噬蛋白;活细胞工作站观察GFP-LC3的变化。并进一步使用自噬工具药验证中药有效成分对自噬流的影响。　　第三部分、人参皂苷Rg1通过PI3K-AKT信号通路对持续营养缺乏诱导的心肌细胞自噬与凋亡的调节作用在中药有效成分药效最显著的时间点建立H9c2细胞营养缺乏模型，考察中药有效成分对PI3K-AKT信号通路关键蛋白及与其相关联的自噬、凋亡蛋白PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、LC3、caspase9、caspase3表达量的影响。　　第四部分、人参皂苷Rg1通过Beclin1-Bcl-2途径对持续营养缺乏诱导的心肌细胞自噬与凋亡相互关系的调节作用　　1.人参皂苷Rg1对持续营养缺乏心肌细胞Beclin1、Bcl-2蛋白表达的影响建立H9c2细胞营养缺乏0-240min模型，Westernblot检测Beclin1与Bcl-2蛋白表达趋势。　　2.人参皂苷Rg1对持续营养缺乏心肌细胞Beclin1-Bcl-2相互关系的影响通过连续多个时间点IP观察人参皂苷Rg1对H9c2细胞营养缺乏0-240min期间Beclin1与Bcl-2的相互作用。并将CFP-Beclin1、YFP-Bcl-2共转染H9c2细胞，通过FRET现象观察药物在营养缺乏开始至细胞死亡期间，对Beclin1与Bcl-2相互关系的影响。　　结果：　　第一部分　　1.与正常对照组(营养缺乏0min)比较，营养缺乏诱导H9c2细胞活力逐渐下降。而在0-240min期间，细胞活力的降低具有较好的时间依赖性。　　2.与正常对照组比较，模型组caspase3整体变化的趋势是先逐渐上升，然后下降，30-210minn期间具有统计学意义(P＜0.05)，在120min时达到高峰。模型组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在细胞营养缺乏30-150min期间逐渐上升，到90min时开始具有统计学意义（P＜0.05），150min时表达量到达高峰，然后逐渐下降。p62表达呈现持续下降的趋势，到90min时开始具有统计学意义(P＜0.05);　　3.与模型组比较，3-MA组caspase3表达量升高(P＜0.05);相反，Rap组caspase3表达量降低(P＜0.05)。　　第二部分　　1.与模型组比较，人参皂苷Rc100μmol·L-1，人参皂苷Re25，50，100μmol·L-1，人参皂苷Rg125，50，100μmol·L-1，对H9c2细胞活力的降低有恢复作用(P＜0.01或P＜0.05);人参皂苷Rc100μmol·L-1，人参皂苷Re50，100μ mol·L-1，人参皂苷Rg125，50，100μmol·L-1，能够降低caspase3表达量（P＜0.01或P＜0.05）;人参皂苷Rg150，100μmol·L-1，能够降低LC3表达量;对三个指标均有明显影响的中药有效成分为:人参皂苷Rg1，最佳剂量为:100μmol·L-1。　　2.与模型组比较，MTT结果显示:人参皂苷Rg1（25，50，100μmol·L-1）在营养缺乏30-240min间各时间点均对细胞活力有增加作用，并且在90-240min期间存在量效关系。药效最佳的剂量为:100μmol·L-1。Westernblot结果显示:人参皂苷Rg1在营养缺乏90-240min降低H9c2细胞caspase3表达量(P＜0.05)。　　与正常对照组比较，流式细胞术检测、TUNEL检测结果显示:细胞凋亡率随营养缺乏时间的延长增加明显，至60min时具有统计学意义(P＜0.05)，并具有时间依赖性。与模型组比较:人参皂苷Rg1在营养缺乏60-240min能够H9c2降低细胞凋亡率(P＜0.05)。　　3.与正常对照组比较，模型组的GFP-LC3荧光强度在营养缺乏0-1.5h期间增加明显，并且细胞伴随形态收缩;在营养缺乏4h左右时，细胞收缩成圆形，停止运动，荧光淬灭。人参皂苷Rg1使GFP-LC3荧光持续时间延长至12h左右，同时伴随细胞维持正常形态时间的延长。　　与模型组比较，Westernblot结果显示:人参皂苷Rg1在细胞饥饿30-90min间提高了LC3的表达量(P＜0.05)，并将其表达高峰提前至90min;同时降低了P62在30-120min间的表达量(P＜0.05)。　　在H9c2细胞营养缺乏90min模型中，当氯喹与人参皂苷Rg1同时作用于细胞时， LC3表达量均明显高于模型组、氯喹组和人参皂苷Rg1组（P＜0.05）。　　第三部分　　与模型组比较，人参皂苷Rg1提高了PI3K、AKT、P-AKT、LC3表达量（P＜0.05或P＜0.01），降低了mTOR、caspase9、caspase3表达量(P＜0.05)。　　第四部分　　与模型组比较，Westernblot结果显示:人参皂苷Rg1在营养缺乏90-240min提高Beclin1表达量，在90-210min提高Bcl-2表达量。IP结果显示:与模型组比较，人参皂苷Rg1使与Beclin1结合的Bcl-2表达量时间依赖性降低，在30min时开始具有统计学意义（P＜0.05）。游离Bcl-2表达量时间依赖性升高，在30min时开始具有统计学意义（P＜0.05）。在营养缺乏150min模型中，人参皂苷Rg1(25，50，100μmol·L-1)使与Beclin1结合的Bcl-2表达量剂量依赖性降低（P＜0.05），游离Bcl-2表达量剂量依赖性升高（P＜0.05）。　　FRET结果显示:在营养模型建立前及建立后初期，Beclin1-Bcl-2相互作用处于稳定状态;至模型建立后240min，Beclin1-Bcl-2相互作用水平开始逐渐升高，420min时到达高峰，然后下降，480min进入平台期。经人参皂苷Rg1处理后，Beclin1-Bcl-2相互作用变化趋势与模型组相似，但是OD值降低，并且具有明显的量效关系（P＜0.05或P＜0.01）。　　结论：　　1.在心肌细胞持续营养缺乏状态下，自噬与凋亡均发生，但是变化趋势不同。当LC3表达量到达高峰时，caspase3表达量开始下降。当抑制自噬时，凋亡水平升高;相反，当促进自噬时，凋亡水平下降。　　2.人参皂苷Rg1对持续营养缺乏的心肌细胞自噬与凋亡均有调节作用。表现为通过提前LC3、p62的表达峰值及提高Beclin1表达量促进自噬;通过降低caspase3表达量及减少细胞凋亡率抑制凋亡。　　3.人参皂苷Rg1通过正向调节PI3K-AKT通路促进自噬、抑制凋亡。　　4.人参皂苷Rg1通过减弱Beclin1-Bcl-2相互作用发挥调节自噬与凋亡动态平衡的作用。