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在全球范围内丙型病毒性肝炎是可致死的十大感染性疾病之一,在我国也是一种常见的传染病。丙型病毒性肝炎由丙型肝炎病毒引发,简称为丙肝,主要传播途径是经体液及血液传播。HCV感染人群中慢性丙型肝炎约占70%～85%,其中60%～70%的慢性感染患者将发展为慢性肝病,包括肝硬化、肝癌等,在肝硬化患者中,每年有1%～4%发展为肝癌。HCV感染会引发肝硬化的产生,同时也是诱发肝癌的最重要原因。丙肝危害极大的另一主要原因是由于目前尚无切实有效的可用于预防丙型肝炎病毒感染的疫苗。在发展中国家,因为诊断技术不成熟以及治疗方法存在缺陷而导致的HCV感染者死亡率在逐渐升高。由于HCV疫苗的研发在短期内很难获得突破性的进展,所以,控制该疫情的发展只能从切断传染源和阻遏传播途径上入手。而HCV感染初期具有极强的感染性,因此对HCV感染者进行及早而准确的诊断是控制丙型肝炎传播的最为有效的手段。因而建立一种具有高灵敏度、特异性和稳定性的针对HCV的筛查方法具有重要的意义。目前常用的HCV检测方法主要包括:①血清中HCV抗体检测;②血清中HCV核心抗原检测;③血液中HCVRNA检测。这三种检测方法在确诊HCV感染、选择患者治疗方案以及评价治疗效果等方面相辅相成,起到了关键性的作用。但由于目前使用的抗HCV检测试剂盒中抗原均为人工合成的具免疫原性的基因工程抗原配比合成肽抗原,其在特异性方面存在不足,可能会出现假阳性结果。此外,由于“窗口期”的存在,在HCV感染初期,感染者体内尚无抗体的产生,因此,在HCV感染早期诊断还需要其他检测策略来弥补其不足。丙肝病毒核心蛋白由氨基酸序列非常保守的大约190个氨基酸编码而成。病人血液中HCV核心抗原的出现是反映HCV感染的重要标志,因此目前可应用于HCV感染“窗口期”的筛查,HCV抗原的检测可将HCV感染的窗口期缩减50天左右。HCV核心抗原检测中较常用的方法是双抗体夹心法。双抗体夹心法可检测血清样品中总的核心抗原或游离的核心抗原,在明显缩短窗口期的同时,不会受到被检样品中所含有的抗-HCV抗体的影响,检测结果可靠,具有方法简单、用时短、对环境要求低、假阳性率低等特点。在暴露于HCV环境中7～21天内,即可在患者外周血中检测到HCV RNA的存在,其含量在血清阳转之前可达到一个峰值,滴度在1×105至1×108拷贝/mL之间。为了实现HCV感染的早期检测,降低感染率,许多国家采用了灵敏度较高的核酸检测法,但技术该技术对设备、试剂及操作方法等要求均较高,而且检测过程易交叉污染,因此很难在发展中国家推行开来。综上所述,联合检测抗HCV抗体及HCV核心抗原将成为检测HCV感染的有效手段之一。本课题利用检测抗原及抗体相结合的方法,可同时检出样本中HCV抗原和抗体,提高了阳性检出率,并可有效缩短HCV检测窗口期,有利于HCV感染早期诊断。通过比较前三代抗-HCV诊断试剂盒中抗原的组份,我们选择了 core及NS3-5重组型抗原检测病人血液中的抗体,同时应用HCV核心抗原保守区两端小肽分别制备HCV抗核心单克隆抗体,利用双抗体夹心法原理检测病人血液中的抗原。本课题的具体研究内容如下:(1)ELISA试剂盒中用于检测抗体的丙肝病毒抗原的表达与纯化:通过PCR获得HCV core-NS3-5基因片段,将其克隆至实验室构建保存的原核表达载体pRSET-BL,然后通过酶切鉴定及测序获得pRSET-BL/HCV core-NS3-5原核表达载体,将该质粒电转化至E.coliBL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白6His-HCV core-NS3-5融合蛋白。该融合蛋白作为ELISA试剂盒中抗原的组份。(2)携带丙型肝炎病毒核心抗原C8-160片段,核心抗原小肽C8-22及C101-115融合蛋白的原核表达载体的构建及其表达纯化:通过公司合成HCV C8-160基因片段、HCV C8-22小肽以及HCV C101-115小肽的Linker。将HCV C8-160基因克隆至实验室构建保存的PGEX-4T-3载体,获得原核表达载体PGEX-4T-3/HCVC8-160。将 HCVC8-22 小肽和 HCVC101-115 小肽分别克隆至实验室保存的pET-28a/HBc-LacZ BS载体和pRSET-B/Grn E BS载体中,获得pET-28a/HBc-HCV C8-22、pET-28a/HBc-HCV C101-115、pRSET-B/Grn E-HCV C8-22和pRSET-B/Grn E-HCV C101-115四种可以表达不同表位小肽的融合蛋白的原核表达载体。将上述五种原核表达载体分别电转化至E.coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白,用于制备针对HCV核心不同抗原表位的单克隆抗体。(3)分别携带核心抗原小肽C8-22和C101-115的真核表达载体的构建:将质粒pAd5/E1-CMV-H1H2-Grn E-Flag用BamHI和SfuI分步双酶切后,分别连入HCV C8-22小肽和HCV C101-115小肽,转染HEK 293细胞72 h后收集上清和全细胞裂解液,用于单克隆抗体的Western Blot检测。(4)针对人IgGFc段的单克隆抗体的制备:用购买自Sigma的人IgG蛋白作为免疫原,第一次免疫时将免疫原和Freund完全佐剂等体积混合,研磨后对小鼠进行皮下多点注射,每只小鼠注射的免疫原总量为40 μg;3周后进行第二次免疫,将免疫原与Freund不完全佐剂等体积混合,每只注射剂量和注射方法均同第一次;2周后进行第三次免疫,此次不加佐剂,采用腹腔注射,注射剂量同前两次。2周后,进行断尾取血,用ELISA检测小鼠血清抗体效价,选择抗体效价达到1:64000以上的2只小鼠,于1周后用该蛋白进行腹腔加强免疫。加强免疫后第2天,将饲养细胞接种于96孔板中,第3天将免疫小鼠的脾细胞按照10:1或5:1比例与SP2/0骨髓瘤细胞通过PEG4000进行融合,以HAT/HT选择培养液筛选杂交瘤细胞,融合7天至10天后,采用ELISA法筛选阳性孔,经过3～4次的亚克隆,阳性率达到100%时,即得到分泌小鼠抗人IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞,随后将杂交瘤细胞转移到24孔板中进行扩大培养并冻存。选择8周龄的BALB/c小鼠制备腹水。收集腹水后获得所需的小鼠抗人IgG单克隆抗体。(5)针对HCV核心不同抗原表位的单克隆抗体的制备:为了制备针对HCV C8-22单克隆抗体的制备,将上述获得的GST-6His-HCV C8-160融合蛋白作为初次免疫原,HBc-HCV C8-22融合蛋白作为加强免疫原,Grn E-HCV C8-22融合蛋白用于杂交瘤的筛选检测,筛选获得阳性杂交瘤细胞,扩大培养及制备腹水后由Western Blot和免疫荧光染色进行鉴定,制备得到针对HCV C8-22的单克隆抗体。针对HCV C101-115单克隆抗体的制备,同上述实验策略,初次免疫原同上,HBc-HCV C101-115融合蛋白作为加强免疫原,Gm E-HCV C101-115融合蛋白用.于筛选,制备获得针对HCVC101-115的单克隆抗体。(6)HCV抗原抗体联合检测体系的建立及其应用:应用针对HCV核心抗原不同抗原表位的单克隆抗体Anti-HCV C8-22和Anti-HCV C101-.115及HCV core-NS3-5重组抗原同时包被酶联板。如果是检测样本中的抗体,使用HRP标记的鼠抗人IgG单抗;如果是检测样本中的抗原,使用与固相包被物有不同抗原决定簇的辣根过氧化物酶标记的抗-HCV核心单克隆抗体,显色后进行定性或定量检测。由此可以检测样品中的HCV抗原或其抗体。通过以上研究获得以下研究成果:(1)成功构建了 pRSET-BL/HCV core-NS3-5原核表达载体,纯化获得6His-HCV core-NS3-5 融合蛋白,浓度为 1.0 mg/mL;(2)成功构建了 PGEX-4T-3/HCV C8-160原核表达载体,纯化获得GST-6His-HCV C8-160 融合蛋白,浓度为 1.0 mg/mL;(3)成功构建了 pET-28a/HBc-HCV C8-22 和 pRSET-B/Grn E-HCV C8-22 原核表达载体,纯化获得携带HCV C8-22小肽的融合蛋白HBc-HCV C8-22浓度为0.1 mg/mL,Gm E-HCV C8-22 浓度为 0.25 mg/mL;(4)成功构建了 pET-28a/HBc-HCV C101-115 和 pRSET-B/Grn E-HCV C101-115原核表达载体,纯化获得携带HCVC101-115小肽的融合蛋白HBc-HCV C101-115 浓度为 0.1 mg/mL,Grn E-HCV C101-115 浓度为 1.2 mg/mL;(5)成功构建了 pAd5/E1-CMV-H1H2-Grn E-HCV C8-22-Flag 和 pAd5/E1-CMV-H1H2-Gm E-HCV C101-115-Flag 真核表达载体;(6)通过杂交瘤技术制备获得3株针对人IgG Fc段的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,它们分别为33E5、30E1和28D11。经Western Blot鉴定,3株单克隆抗体均特异性针对人IgGFc段。均为IgG1亚类。经ProteinGPlus/ProteinA-Agarose亲和层析法纯化后浓度分别为2.28 mg/mL、1.07 mg/mL和1.61 mg/mL。(7)采用联合免疫的方法,通过杂交瘤技术制备获得3株针对HCV C101-115抗体,它们分别为39A6、43C6和73B6。经Western Blot和免疫荧光染色鉴定,3株单克隆抗体均特异性针对HCV C101-115抗原。均为IgG1亚类。经Protein G Plus/Protein A-Agarose 亲和层析法纯化后浓度分别为 3.41 mg/mL、5.15 mg/mL 和 1.09 mg/mL。上述研究成果为HCV诊断提供了特异性抗体及抗原,为进一步研究HCV的防治途径奠定了重要基础;同时也为小肽的单抗制备提供了一种更有效的免疫方案。