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肾缺血再灌注损伤(Renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是泌尿外科手术治疗肾脏疾病过程中常见的病理生理现象,多发生于肾挤压伤、肾单位保留、肾脏移植等临床治疗过程中。肾脏在缺血过程及其后血液再灌注过程中,会有大量活性氧族(reac-tive oxygen species,ROS)产生,导致肾脏损伤。因此,氧化应激被认为是引发缺血再灌注损伤的主要机制之一。肝脏是人体内重要的消化、分泌、解毒、排泄器官。我们以前的研究发现:肾缺血再灌注损伤发生后,肝脏也会处于氧化应激状态并遭受过氧化损伤。核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)是已发现的内源性抗氧化应激转录调控因子。Nrf2通过与抗氧化反应元件(antioxidant responsive element,ARE)相互作用调节抗氧化蛋白的表达。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是机体内主要的ROS清除酶系,同时SOD也接受Nrf2的调控,是其转录调控的靶基因之一。莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是Nrf2通路的诱导剂,它可以通过上调Nrf2及受Nrf2转录调控的靶基因的表达发挥抗肿瘤、抗氧化等生物学作用。西兰花等十字花科蔬菜中SFN的含量丰富。SFN能否通过抗氧化通路改善肾缺血再灌注所诱发的肝脏过氧化损伤未见报道。本研究通过钳夹左肾动脉建立大鼠RIRI模型,RIRI模型组大鼠给予SFN,观察SFN处理的大鼠RIRI模型肝组织形态及功能变化、H2O2含量、MDA含量及抗氧化蛋白SOD活性及表达变化,探讨SFN在防治RIRI诱发的肝脏过氧化损伤中发挥的抗氧化作用。目的:通过观察莱菔硫烷处理的大鼠RIRI模型肝组织形态学和功能变化,肝组织H2O2含量、MDA含量,肝组织抗氧化蛋白SOD活性及表达变化,探讨RIRI发生后莱菔硫烷是否可通过上调Nrf2调控的基因SOD的表达,增强肝组织的ROS清除作用,降低肝组织过氧化损伤程度,为莱菔硫烷对肾缺血再灌注所诱发肝组织损伤的防治研究提供数据依据。方法:1动物模型建立及检测标本的处理购于河北医科大学实验动物中心的雄性Wistar大鼠(体重200±10 g)24只,随机分为对照组(Control组)、肾脏缺血再灌注损伤模型组(RIRI组)、缺血+莱菔硫烷组(SFN1组),灌注+莱菔硫烷组(SFN2组)。RIRI实验动物模型制备:腹腔注射6%水合氯醛(5ml/kg)麻醉大鼠。将RIRI组大鼠固定于手术台上,酒精消毒后开腹充分暴露双侧肾脏,先将大鼠的右侧肾脏切除后,再钝性地分离其左侧肾动脉,并采用无创伤性动脉夹在接近肾门部位夹闭左侧肾动脉,阻断肾脏血液供应,此时可以观察到肾脏颜色由鲜红色迅速转变为暗红色。血液灌注阻断45分钟后弃去动脉夹,重新恢复左侧肾脏的血液灌注,此时可见左侧肾动脉迅速充盈,肾脏颜色也随即由暗红色转变为鲜红色,提示左侧肾脏的血液重新灌注成功。Control组大鼠的消毒开腹过程与RIRI模型组一致,但该组大鼠双侧肾脏暴露后只切除其右侧肾脏,钝性地分离左侧肾动脉,但并不夹闭阻断血液灌注。SFN1组大鼠在夹闭左侧肾动脉后立即将二甲基亚砜稀释的莱菔硫烷均匀涂抹于小肠表面,其余操作步骤同RIRI组。SFN2组大鼠在弃去血管夹恢复肾脏血液灌注后立即将二甲基亚砜稀释的莱菔硫烷均匀涂抹于小肠表面,其余操作步骤同RIRI组。Control组和RIRI组只在小肠表面涂抹等量的二甲基亚砜。恢复大鼠肾脏血流灌注24小时后重新麻醉大鼠,收集右颈总动脉血液,3000转/分,离心10分钟,分离并收集血清,用于血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)含量检测;大鼠处死后切取其肝脏,取适宜大小的肝脏标本置于4%多聚甲醛固定液中固定,用于HE染色法观察大鼠肝组织的形态学改变。将其余肝脏组织迅速置于液氮中,待冷冻后转移至-80℃冰箱保存备用,用于大鼠肝组织SOD活性、基因表达水平测定,丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)含量测定。2检测指标及测定方法2.1大鼠血清内ALT含量检测采用微板法检测大鼠血清ALT含量。ALT含量的测定过程严格按照试剂盒操作说明进行。2.2大鼠肝组织形态结构改变的观察采用HE染色法观察肝组织形态结构的改变。将4%多聚甲醛固定的肝脏标本按梯度酒精脱水、二甲苯透明,石蜡包埋处理后,将肝脏标本切片厚度约5μm,然后进行苏木精伊红染色处理,采用奥林帕斯光学显微镜观察肝组织形态学改变并拍照。2.3大鼠肝组织MDA含量检测肝组织MDA含量采用硫代巴比妥酸比色法测定,检测过程按试剂盒操作说明进行。2.4大鼠肝组织H2O2含量检测肝组织H2O2含量采用钼酸比色法测定,检测过程按试剂盒操作说明进行。2.5大鼠肝组织SOD活性检测肝组织SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定,检测过程按试剂盒操作说明进行2.6大鼠肝组织SOD基因表达水平检测采用RNA提取试剂盒裂解提取大鼠肝组织内的总RNA。RNA定量后将2μg RNA反转录成模板c DNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参照,进行Real-Time PCR相对定量分析。结果:1大鼠肝组织的HE观察结果HE法观察大鼠肝组织形态结构改变。光镜下可见:Control组大鼠肝细胞大小均匀,围绕中央静脉排列成条索状,肝血窦大小均匀未见异常;RIRI组大鼠:肝细胞萎缩体积变小,肝血窦扩张。SFN1组大鼠:肝细胞肿胀体积增大,肝血窦被挤压变窄,偶可见空泡变性;SFN2组大鼠:部分肝细胞萎缩,肝血窦略有扩张,肝细胞内可见有大量空泡数量多于SFN1组。2血清内ALT含量的改变与Control组大鼠血清内ALT的含量(15.02±2.43 U/L)相比,RIRI组(210.27±29.94 U/L)、SFN2组(161.71±21.76 U/L)、SFN1组(111.25±17.94 U/L)大鼠血清ALT含量均明显升高(P<0.05),但SFN2组和SFN1组大鼠血清ALT含量低于RIRI组(P<0.05),SFN1组大鼠血清ALT含量又低于SFN2组(P<0.05)。3肝组织MDA含量的改变与Control组大鼠肝组织MDA含量(45.08±6.35 mmol/g)相比,RIRI组(96.49±12.38 mmol/g)、SFN2组(68.86±9.15 mmol/g)、SFN1组(54.62±9.57 mmol/g)大鼠肝组织MDA含量均升高(P<0.05),但SFN2组和SFN1组大鼠肝组织MDA含量低于RIRI组(P<0.05),SFN1组大鼠肝组织MDA含量又低于SFN2组(P<0.05)。4肝组织H2O2含量的改变与Control组大鼠肝组织H2O2含量(55.49±8.75 mmol/g)相比,RIRI组(124.15±18.52 mmol/g)、SFN2组(96.09±12.14 mmol/g)、SFN1组(75.00±11.14 mmol/g)大鼠肝组织H2O2含量均升高(P<0.05),但SFN2组和SFN1组大鼠肝组织H2O2含量低于RIRI组(P<0.05),SFN1组大鼠肝组织H2O2含量又低于SFN2组(P<0.05)。5大鼠肝组织SOD活性改变与Control组大鼠肝组织SOD活性(133.33±14.21 U/mg pro)相比,RIRI组(53.36±7.28 U/mg pro)、SFN2组(73.46±8.96 U/mg pro)、SFN1组(86.75±10.16 U/mg pro)大鼠肝组织SOD活性均降低(P<0.05),但SFN2组和SFN1组大鼠肝组织SOD活性高于RIRI组(P<0.05),SFN1组大鼠肝组织SOD活性又高于SFN2组(P<0.05)。6肝组织SOD基因的表达改变Real-Time PCR法测定大鼠肝组织SOD的m RNA相对表达水平,GAPDH作为扩增内对照。与Control组大鼠肝组织SOD m RNA表达量(0.79±0.09)相比,RIRI组(0.99±0.15)、SFN2组(1.22±0.15)、SFN1组(1.31±0.13)大鼠肝组织SOD m RNA表达水平均升高(P<0.05)。SFN2组和SFN1组大鼠肝组织SOD的m RNA相对表达水平又高于RIRI组(P<0.05),但SFN2组和SFN1组SOD的m RNA相对表达水平无明显差异(P﹥0.05)。此结果表明:在肾缺血再灌注损伤发生过程中,SFN上调了肝组织SOD基因表达水平。结论:1肾脏缺血再灌注损伤发生后,莱菔硫烷通过上调肝组织Nrf2下游基因SOD的表达,增强了对ROS的清除作用,降低了肝组织的过氧化损伤程度。2与再灌注后给药相比,缺血后即刻给予莱菔硫烷更能有效降低肝组织氧化应激水平和过氧化损伤程度,改善肝组织的形态结构和功能改变。