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L-亮氨酸是人和动物自身不能合成必须依靠外源供给的八大必需氨基酸之一,具有多种生理功能,在食品、动物饲料、化妆品和医药等行业都具有非常广泛的应用。随着人们保健意识的增强,对L-亮氨酸需求的不断增加,利用微生物发酵法生产L-亮氨酸得到了越来越多的关注和重视。同时,随着分子生物学技术的不断发展和对谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）L-亮氨酸合成机制的深入研究,利用代谢工程手段去改造微生物生产L-亮氨酸得到了越来越多的关注。本论文以一株经过诱变选育产L-亮氨酸的谷氨酸棒杆菌C.glutamicum XQ-9为出发菌株,进行代谢工程改造,以提高L-亮氨酸产量,并进一步优化培养基和发酵条件,提高了目的菌株的L-亮氨酸合成能力。主要研究结果如下:（1）提高L-亮氨酸合成关键酶活性并改善辅因子供应平衡胞内氧化还原水平。对C.glutamicum XQ-9 L-亮氨酸生物合成过程中关键酶的编码基因进行测序分析,发现关键基因都存在多个氨基酸突变,推测这些氨基酸突变一定程度上解除了L-亮氨酸合成过程中关键酶所受到的反馈抑制和阻遏。敲除对异丙基苹果酸异构酶（IPMI）和异丙基苹果酸脱氢酶（IPMD）有阻遏作用的调控蛋白（LtbR）编码基因ltbR和过表达关键酶基因leuA和ilvBNCE,强化L-亮氨酸合成能力。根据辅酶结合位点的预测分析,对乙酰羟基异构酶（AHAIR）的第34、48和49位氨基酸进行定点突变,由原来的S、L和R突变为G、E和F,使AHAIRM由原来主要利用辅因子NADPH变成利用NADH。异源表达来源于球状芽孢杆菌（Lysinibacillus subtilis）的依赖NADH的亮氨酸脱氢酶（Leu DH）,获得菌株XL-2。菌株XL-2/ABNCMLDH提高对NADH的利用,减少了NADPH的消耗,胞内NADPH含量提高到5.34μmol.g-1,NADPH/NADP+为0.81。摇瓶发酵结果表明,菌株XL-2/ABNCMLDH的L-亮氨酸产量为22.9 g·L-1,胞内副产物缬氨酸的积累量仅为3.7 g·L-1,有利于发酵生产L-亮氨酸的下游分离纯化。（2）增强前体丙酮酸的有效利用提高L-亮氨酸产量。通过调控菌株XL-2中的TCA循环回补途径和弱化L-丙氨酸合成途径增强丙酮酸的有效利用,提高丙酮酸向L-亮氨酸合成方向的代谢通量。首先,敲除丙酮酸羧化酶（PC）编码基因pyc,切断丙酮酸合成草酰乙酸途径,弱化TCA循环回补途径,增强丙酮酸向L-亮氨酸合成方向的代谢通量;敲除和L-亮氨酸竞争前体丙酮酸的丙氨酸转移酶AvtA参与的L-丙氨酸合成途径,降低了胞内丙酮酸的竞争性消耗;最后,通过对alaT基因前添加不同强度的终止子优化alaT基因的表达,弱化胞内AlaT酶活水平,进一步减少副产物L-丙氨酸的积累,提高L-亮氨酸的产量,最终得到菌株WL-8。摇瓶发酵结果表明,菌株WL-8的L-亮氨酸产量增加至18.1 g·L-1。（3）强化L-亮氨酸合成途径的代谢强度。首先,在菌株WL-8中依次利用延伸因子Tu编码基因eftu启动子Ptuf替换操纵子ilvBNC和基因leuA的启动子PilvBNC和PleuA,增强L-亮氨酸合成基因转录水平,强化L-亮氨酸合成途径的代谢强度,同时也抑制了L-丙氨酸和L-缬氨酸的合成通量。过表达关键酶基因leuA,促进L-缬氨酸直接前体α-酮异戊酸合成α-异丙基苹果酸,提高L-亮氨酸合成途径的代谢流。最后,为了消除携带质粒对菌体生长造成负担,在基因组上增加leuA基因的拷贝数增强IPMS酶活水平,促进α-酮异戊酸向L-亮氨酸合成方向的代谢流,提高L-亮氨酸产量,最终获得菌株WL-13。摇瓶发酵结果表明,菌株WL-13的L-亮氨酸产量增加至28.7 g·L-1。同时,菌株WL-13中L-缬氨酸和L-丙氨酸积累量都明显降低。（4）提高乙酰CoA的供应及强化葡萄糖代谢。首先在菌株WL-13中柠檬酸合成酶（CS）编码基因gltA前插入强度为40.39 a.u.的终止子弱化gltA基因的转录水平,减少乙酰CoA的消耗,为L-亮氨酸的合成提供更多的前体物质。然后,异源表达来源于大肠杆菌的乙酰CoA合成酶（Acs）编码基因acs和对Acs有激活作用的调控因子CobB编码基因cobB,在谷氨酸棒杆菌中构建了乙酸直接合成乙酰CoA的代谢途径,提高了乙酰CoA的供应,促进L-亮氨酸的合成,但也引起糖耗速率降低。之后,敲除转录调节因子SugR编码基因sugR,解除对特异性转运蛋白酶II编码基因ptsG的转录抑制作用,强化了PTSGlc途径对葡萄糖的转运,提高了葡萄糖的消耗速率,获得菌株JL-3。最后,菌株JL-3/AcsCobB摇瓶发酵结果,L-亮氨酸产量提高至30.9 g·L-1。（5）通过响应面设计和单因素实验方法优化了L-亮氨酸发酵培养基组成和发酵条件。确定了摇瓶发酵生产L-亮氨酸的最佳培养基(g.L-1):葡萄糖140,玉米浆22,硫酸铵23,醋酸铵15,柠檬酸钠3,尿素3,KH2PO4 0.8,MgSO4.7H2O 0.5,MnSO4.H2O0.01,L-蛋氨酸0.7,L-异亮氨酸0.06,L-谷氨酸0.5,生物素5×10-5,硫胺素2×10-4;最佳发酵条件:装液量50 mL/500 mL,接种量10%,pH7.0,发酵温度30℃。优化后L-亮氨酸发酵产量达到32.8 g·L-1,比优化前提高了6.1%。在5 L发酵罐水平对L-亮氨酸发酵过程溶氧和补料进行优化控制,溶氧水平控制在15%,残糖浓度维持20 g·L-1,进行补料分批发酵,L-亮氨酸产量达到40.1 g·L-1,糖酸转化率是0.25 g·g-1。