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核苷类化合物是抗癌、抗病毒药物的主要来源,阿糖鸟苷(ara-G)作为奈拉滨等的前药,能够有目的地抑制T细胞白血病的细胞活性,也是一种关键的抗癌类核苷类药物。目前利用化学合成法工艺比较麻烦,使用某些化学试剂对人体和环境都可能造成一定的危害;而生物催化法在一定程度上可以解决上述问题,但也存在野生菌株酶产量较低而导致成本较高、同时一些产酶的微生物菌体本身可能具有致病性,从而阻碍了工业化生产。本文通过分子生物学技术对ara-G生物合成过程中所用关键酶进行克隆表达,以获得催化反应所用酶的高产基因工程菌,大幅度降低成本,为工业化生产奠定基础。1.嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)与尿苷磷酸化酶基因(udp)工程菌的构建:根据GenBank中的deoD与udp的序列设计引物,利用PCR扩增来源于埃希氏菌AEM0812菌株的deoD与udp基因,将基因片段分别与克隆载体pMD18-T连接得到重组质粒pMD18-T-deoD和pMD18-T-udp,再将重组质粒分别导入Escherichia coli DH5α获得目的基因的克隆;然后将目的基因分别与表达载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-deoD和pET-28a-udp,导入E.coli BL21(DE3),获得工程菌菌株E.coli(deoD)、E.coli(udp);经IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE检测表明目的基因表达成功。工程菌E.coli(deoD)与E.coli(udp)粗酶液酶活力分别是原始菌株的1.9倍与1.2倍。2.工程菌E.coli(deoD)或E.coli(udp)催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷(ara-DA):利用E.coli(deoD)或E.coli(udp)游离细胞或由其制备的粗酶液分别催化第一步反应,均能够生成ara-DA,并且E.coli(deoD)与E.coli(udp)游离细胞转化率比原始菌株AEM0812分别提高24.6%与22.3%,E.coli(deoD)与E.coli(udp)的粗酶液比原始菌株分别提高28.2%与2.0%;将E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游离细胞或粗酶液按照1:1的比例混合参与反应时,转化率相对于原始菌株AEM0812有明显的提高,尤其是E.coli(deoD)和E.coli(udp)的游离细胞的混合液效果最佳,转化率是原始菌株的2.5倍。3.腺苷脱氨酶基因(add)工程菌的构建:将来源于Pseudomonas aeruginosa TX16菌株的add基因克隆后导入E.coli BL21(DE3),得到含有重组质粒pET-28a-add的工程菌E.coli(add),经IPTG诱导后采用SDS-PAGE检测,表明目的基因表达成功。酶活测定表明E.coli(add)粗酶液的酶活力是原始菌株P.aeruginosa TX16的2.9倍。4.工程菌E.coli(add)催化合成ara-G:将E.coli(add)菌体直接加入到含有ara-DA的反应体系中,HPLC检验结果表明E.coli(add)菌体游离细胞几乎不能催化合成ara-G;将E.coli(add)菌体细胞破碎后制成粗酶液再进行反应,可以成功催化第二步反应生成ara-G,而且转化率比原始菌P.aeruginosa TX16有非常显著的提高,其转化率可达96.8%,是原始菌株的2.2倍。