RNAi是由dsRNA引发的,靶向切割mRNA的高效特异的基因沉默技术。由于该技术具有高效性和便捷性,因此RNAi技术在包括基因功能研究、高通量靶标基因筛选、基因治疗、药物靶标预测和农业病虫害防治等领域均有广泛应用。RNAi实现方式包括显微注射、浸泡和饲喂法。虽然RNAi是一种广泛存在于多种真核生物并高度保守的机制,但是RNAi的应用仍然面对很多问题,例如包括许多双翅目昆虫在内的部分物种中RNAi难以实现和RNAi效应持续时间较短等。橘小实蝇的RNAi研究目前尚属空白。橘小实蝇是一种重要的农业害虫,为害250多种蔬果。本研究以橘小实蝇为研究对象,建立橘小实蝇的饲喂法RNAi体系；利用RNAi技术研究橘小实蝇spr基因和共生病毒功能；首次发现了橘小实蝇对RNAi的免疫耐受现象并阐述其机制。1.成功建立了橘小实蝇饲喂法RNAi体系。直接喂食靶标基因dsRNA和喂食表达靶标基因dsRNA的大肠杆菌均可以实现目的基因沉默。其中rpll9 dsRNA喂食组橘小实蝇rpll9基因表达量在喂食后第1天和第7天分别出现了89%和85%的下调。在表达rpll9 dsRNA大肠杆菌喂食组中,rpll9基因表达水平于第1天和第7天出现了30%的下调。在V-ATP-D dsRN A喂食组中,V-ATP-D基因表达水平在第4天出现了幅度为36%下调。在表达V-ATP-D dsRNA的大肠杆菌喂食组中,V-ATP-D基因表达水平在第4天出现了50%的下调。我们同时发现靶标基因在饲喂dsRNA和表达dsRNA的菌液后于第2天或第4天出现了上调dsRNA喂食组橘小实蝇rpll9基因表达量在喂食后第4天出现了3倍的上调。在表达V-ATP-D dsRNA的大肠杆菌喂食组中,V-ATP-D基因表达水平在第2天出现了1.6倍的上调。组织特异性检测结果表明饲喂法RNAi所引起的RNAi不局限于中肠,可以在头、生殖系统和脂肪体中观察到。其中,dsRNA喂食RNAi导致noa基因表达水平于生测后第2天在头、卵巢、精巢和脂肪体中分别出现了64%、23%、95%和89%的下调。连续喂食rpl19 dsRNA 12天后,rpll9基因表达水平恢复到正常,与egfp dsRNA喂食组无显著差异。同时,使用500ng/μl、100ng/μl和10 ng/μl rpl19 dsRNA进行橘小实蝇喂食RNAi实验均观察到rpll9基因表达水平于12天后恢复至正常水平。使用羽化后5天和羽化后10天橘小实蝇进行的rpl19 dsRNA喂食实验也观察到这一现象。上述结果表明这一现象与生测所用橘小实蝇的虫龄以及生测使用的dsRNA浓度无关。对F2代成虫RNAi效应检测结果表明亲代的RNAi干扰对子代没有影响。对子代初羽化成虫进行的rpll9 dsRNA喂食实验结果表明rpll9基因表达水平下调了66%,与亲代未经RNAi处理的F2代成虫喂食RNAi结果一致。2.我们首次发现橘小实蝇可以对RNAi产生免疫耐受并阐述了其机制。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi导致rpll9基因下调66%；在此基础上进行的第二次喂食rpll9 dsRNA的RNAi无法引起rpll9基因下调。结果表明第一次针对内源基因的RNAi可以使橘小实蝇对RNAi产生免疫耐受现象。同时这种免疫耐受现象是非基因特异的。第一次喂食rpl19 dsRNA的RNAi同样使橘小实蝇对第二次喂食spr dsRNA的RNAi产生免疫,spr表达水平在第二次RNAi中不出现下调。1000ng/μl rpl19 dsRNA引起的橘小实蝇对RNAi的免疫耐受性持续20-30天；100 ng/μl和10 ng/μl rpl19 dsRNA引起的橘小实蝇对RNAi的免疫耐受性分别持续10-20天和5天,表明橘小实蝇对RNAi的免疫耐受性的持续时间和第一次RNAi中所使用的dsRNA浓度相关。通过巴弗洛霉素处理橘小实蝇肠道,我们发现橘小实蝇的dsRNA摄取是由胞吞机制调控的。荧光免疫染色研究结果表明在对RNAi免疫耐受的橘小实蝇中,dsRNA摄取机制受到了阻遏,dsRNA无法正常进入细胞。在对RNAi免疫耐受的橘小实蝇中,che、light、cog3、ap50和nina c等基因均出现了30%-60%的下调,表明其对RNAi的免疫耐受性是由胞吞机制的活性下降所引起的。这一结论也得到了高通量测序结果的支持。高通量测序发现参与细胞运输的chc、actinl、actin2和actin5等基因出现下调。而通过利用双氧水促进肌动蛋白形成可以解除橘小实蝇对RNAi的免疫耐受。5%的H202与100 ng/μl rpl19 dsRNA共喂食引起对RNAi免疫耐受的橘小实蝇中rpll9基因表达水平出现50%的下调。这些研究结果证实了胞吞机制受阻是橘小实蝇对RNAi产生免疫耐受现象的关键原因。3.通过上述建立的RNAi技术发现spr参与了橘小实蝇交配后抗氧化胁迫能力的改变。通过克隆获取橘小实蝇spr基因全长,该基因编码324个氨基酸。cDNA序列十分保守,与地中海实蝇spr相似度为86%(E值=0)。spr表达模式结果显示spr在中肠中表达量最高,其次为后肠和头部。spr在不同发育阶段的橘小实蝇中均有表达,其中在幼虫和蛹期表达水平最高。研究结果发现橘小实蝇交配后雌虫的抗氧化胁迫能力下降。在双氧水生测中,交配后的雌虫存活率明显低于未交配雌虫,生测开始后72小时的交配组雌虫存活率为9.4%,在同一时间点,未交配雌虫存活率为56.7%(p=0.017)。同时交配后TOR信号通路的rheb基因上调了88%、tor基因上调了28%。此外,TOR通路的关键效应基因s6k上调了54%,表明橘小买蝇对氧化胁迫敏感性上升；而通过显微注射spr dsRNA,成功敲除spr,使spr基因表达水平下调了75%后,橘小实蝇交配后抗氧化胁迫能力不变,TOR通路基因的表达水平也未发生变化。这些结果表明spr通过TOR通路参与了橘小实蝇交配后抗氧化胁迫能力的改变。4.利用RNAi技术研究橘小实蝇共生病毒的功能。根据DGE和转录组测序结果,我们鉴定了8个橘小实蝇共生病毒序列。其中contig1697、contig475、comp2791和comp11365编码双顺反子病毒科病毒的结构蛋白或者非结构蛋白。comp3227和comp 16524编码RdRp聚合酶,属于弹状病毒科(Rhabdoviridae)。我们利用comp 11365病毒RdRp序列确认其分类地位为小RNA病毒目(Picomavirales)、双顺反子病毒科(Dicistroviridae)、蟋蟀麻痹病毒属(Cripavirus),并将其命名为Bdv-1。Bdv-1病毒主要分布于橘小实蝇中肠,其含量为生殖系统的3000倍。使用饲喂法干扰Bdv-1表达后,我们检测到橘小实蝇中肠中Bdv-1含量下调了48%。饲喂法干扰Bdv-1后,我们发现橘小实蝇中肠总菌群下降了54%左右。γ变形菌、拟杆菌和放线菌与egfp dsRNA对照组相比均出现了约50%的下调。α变形菌与厚壁菌在饲喂法干扰Bdv-1后与egfp dsRNA对照组无显著性差异。这些结果证明Bdv-1与肠道菌群数量相关。