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宫颈癌(cervical cancer,CC)是最常见的妇科恶性肿瘤之一,其发生率居全球第二位。我国是宫颈癌的高发国家,近年来发病有明显年轻化趋势,严重威胁着女性的健康和生命。IL-8是与炎症相关的多功能趋化因子,不仅可以诱导肿瘤血管生成,还可促进肿瘤细胞的增生和迁移。已有研究表明IL-8与多种肿瘤(如宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、胃癌等)的浸润、转移、临床分期及预后密切相关。本课题组前期对早期宫颈鳞癌(Squamous CervicalCarcinoma,SCC)进行了cDNA基因芯片筛查,结果表明IL-8在有淋巴结转移宫颈癌组织中的表达较无淋巴结转移宫颈癌组织高3.4倍,并经体外实验证明IL-8可通过促进宫颈癌细胞的增生、迁移、与内皮细胞的黏附作用及促进宫颈癌的血管生成等机制提高宫颈癌的浸润转移能力。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是新发展起来的抑制基因表达的有效方法,本课题通过构建IL-8小发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体,探讨其能否抑制宫颈癌CaSki细胞株中IL-8基因表达,以及对宫颈癌细胞生物学行为的影响,探索RNA干扰技术作为宫颈癌基因治疗新策略的可行性。目的:构建经EGFP绿色荧光标记的IL-8shRNA真核表达载体,探讨其对宫颈癌CaSki细胞株中IL-8基因和蛋白表达的抑制效果,以及其对宫颈癌细胞增生、趋化运动的抑制作用。方法:首先,根据Genbank中报道的IL-8cDNA序列合成2对IL-8shRNA对应RNAi作用靶点的寡核苷酸序列及1对阴性对照序列,并将其定向克隆入真核表达载体PGenesil-1中。其次,利用脂质体将经荧光标记的IL-8shRNA真核表达载体转染入宫颈癌CaSki细胞株中,以荧光显微镜观察其转染效率,以RT-PCR方法检测转染前后IL-8mRNA的变化,以ELISA和免疫细胞化学法检测转染前后IL-8蛋白表达情况。最后,应用MTT法、集落形成实验以及Boyden小室法检测转染前后各组增殖和趋化运动有何差异。结果:经酶切鉴定及DNA序列测定证实IL-8shRNA真核表达载体已成功构建。利用脂质体转染经荧光标记的IL-8shRNA真核表达载体,瞬时转染72h小时倒置显微镜观察发现各组转染IL-8 shRNA表达质粒对细胞形态及生长状态无明显影响。72小时经多视野阳性细胞计数计算CaSki细胞的转基因效率约为60.37%±0.68%。RT-PCR检测IL-8 shRNA1与IL-8 shRNA2对IL-8mRNA的抑制率分别为63.90%和71.14%,ELISA检测结果表明IL-8shRNA1与IL-8 shRNA2对IL-8蛋白表达的抑制率分别为60.80%和72.13%,与RT-PCR结果基本一致,且IL-8 shRNA2抑制作用更为有效。用抑制效果好的IL-8shRNA2质粒转染CaSki细胞进行免疫细胞化学检测,结果表明IL-8呈弱阳性表达,而转染阴性对照质粒和空白对照的CaSki细胞IL-8呈强阳性表达。MTT法、集落形成实验以及Boyden小室进行实验,结果表明IL-8shRNA2质粒表达载体转染后可明显抑制癌细胞的增殖、趋化作用,与对照组相比具有显著差异(P＜0.05)。结论:IL-8shRNA真核表达载体可以特异、高效地抑制宫颈癌CaSki细胞株IL-8基因和蛋白的表达,并且可以降低CaSki细胞的克隆形成率,抑制其增殖和趋化运动能力,有望成为宫颈癌基因治疗的合理策略之一。