研究背景尿路感染（urinary tract infection,UTI）是临床常见的感染性疾病。根据其解剖部位可分为上尿路感染及下尿路感染,根据其病程特点还可分为急性尿路感染、慢性尿路感染和复发性尿路感染等。尿道的解剖特点决定了其与外界环境相沟通,为细菌入侵提供了方便的途径。通过尿液的排空、抗菌肽的产生、尿路上皮剥脱等机制,泌尿系统维持在一个无菌的状态。长期以来,尿液被认为应为无菌,但近来越来越多的研究指出,尿液的无菌性是相对的。与肠道菌群类似,其中可能存在着低于检测阈值的少量细菌构成的微生态菌群。尿路感染的致病菌类型广泛,包括:尿路致病性大肠杆菌（Uropathogenic E.coli,UPEC）、肺炎克雷伯杆菌、变形杆菌、肠杆菌属、沙雷菌属、粪肠球菌和葡萄球菌等。其中最常见的为尿路致病性大肠杆菌。UPEC又包括临床肾盂肾炎患者来源的菌株CFT073,膀胱炎患者来源的UTI89等多种品系。其作用机制涉及到菌毛的侵袭固定,脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的毒性作用等。LPS曾经在许多细胞学实验和动物实验中替代UPEC构建UTI模型,其机制为LPS在分化抗原簇（cluster of differentiation,CD）14 存在的环境中与 Toll 样受体（Toll-like receptor,TLR）4 结合,从而引起白介素（interleukin,IL）-6、IL-8、激活B细胞的核因子κ-轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NFκB）等一系列细胞因子及趋化因子的释放,介导机体的初始免疫反应。尿路感染的主要临床表现包括尿频、尿急、尿痛、排尿困难、排尿灼烧感等。女性患病率普遍高于男性,其中老年女性更是高发病人群。患者有无临床症状,为是否对患者进行临床干预的重要指征。对于患有无症状性菌尿的男性和非妊娠期女性,治疗是不必要的,过度的治疗反而会造成抗生素滥用和抗生素耐药的问题。小鼠作为常用的实验动物,其实验结果可以更好的帮助临床尿路感染的相关机制研究。小鼠有很多不同的品系,各品系之间的基线排尿行为从尿动力学测定或排尿行为学实验等多种方法层面都具有差异。同时,小鼠的排尿行为与其社会关系,焦虑状态也存在相关性。我们采用小鼠这一实验动物构建尿路感染模型,对尿路感染中可能发生的排尿行为变化进行了急性期和慢性期的观察。同时,通过分析整个病程中的尿液、组织的细菌负荷及炎性因子等指标,以期对排尿行为变化的机制及特点进行探讨。在构建小鼠尿路感染模型过程中,很大一部分小鼠可以在短时间内快速清除掉侵入的病原体,进而表现为对尿路感染抵抗。这种特质一方面与小鼠品系相关,另一方面在同品系小鼠中依然出现不同的表型,体现为尿液细菌负荷低于104菌落形成单位（colony forming unit,CFU）/ml。这种情况在临床患者中也并不少见。尿道与外部环境相通,但即使在相同的病因条件下,并非所有有尿路感染风险的患者最终都会发展为急性或慢性尿路感染,对此,我们对发展为慢性尿路感染的小鼠在尿路感染急性期的尿液细胞因子、细菌负荷特点及排尿行为变化进行分析,希望以此总结慢性尿路感染易感小鼠的急性期特点,从而为更多的基础理论研究提供丰富参考数据。尿路感染在女性患者的发病率显著高于男性,且老年期女性尤甚。这种结果可能与女性尿道的解剖结构相关,但雌激素的作用亦不可忽视。我们由此也简单探讨了雌激素及其受体β对小鼠慢性UTI的影响。以期对女性患者的UTI预防及治疗提供更多的理论基础。第一部分:尿液炎性因子及细菌负荷与小鼠UTI模型排尿行为改变的相关性分析目的尿路感染的发生伴随着尿频、尿急等一系列排尿症状,虽然大量研究探讨过尿路感染相关的炎症免疫机制,鲜有研究对UTI中的排尿行为改变及其原因进行探索。为此我们构建C57BL/6小鼠尿路感染模型,对其进行4周的追踪观察,分析小鼠尿路感染模型中排尿行为与尿液中炎性细胞因子/趋化因子、细菌负荷的相关性。以期对尿路感染的免疫学及行为学机制进一步了解。方法本实验纳入了 14只10周左右的雌性C57BL/6野生型小鼠,给予108 CFU/50μl的UPEC UTI89膀胱灌注两次,间隔24小时,以构建慢性尿路感染模型。灌注期间给予异氟烷吸入麻醉。感染后第1、3、7、10、14、21 及 28 天（day post infection,dpi）,用尿斑实验（voiding spot assay,VSA）测定小鼠排尿行为,用尿液细菌培养评估小鼠细菌负荷。取1 dpi及28 dpi的尿液测定炎性因子含量。我们对急性感染期的尿斑实验参数、尿液细菌负荷及尿液炎性因子进行了两两相关性分析,对慢性感染期的尿斑实验参数、尿液细菌负荷及尿液炎性因子同样进行了两两相关分析。实验数据采用平均数±标准误（standard error of mean,SEM）表示,细菌滴度均取对数值后分析,组间差异采用 T检验或方差（analysis of variance,ANOVA）检验,相关性分析采用Spearman检验,p＜0.05设定为具有统计学差异。结果1.在感染后第1天,即急性感染期,尿液的CFU与尿斑实验中代表多尿的一些参数:尿斑总尿量,尿斑总数呈现正相关性。2.在1 dpi,IL-10,IL-12及IL-13与代表膀胱过度活动症（overactive bladder,OAB）样排尿的尿斑参数正相关。3.在 1 dpi,IL-1β,巨噬细胞集落刺激因子（Macrophag-colony stimulating factor,M-CSF）,巨噬细胞炎性蛋白（macrophage inflammatory proteins,MIP）-1α,MIP-1β,调控活化正常 T 细胞表达及分泌的趋化因子（regulated on activation,normal T cell expressed and secreted,RANTES）及 肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）α,IL-3,IL-6,干扰素 γ 诱导的蛋白（interferon gamma-induced protein,IP）-10,白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF）与代表多尿的尿斑参数相关。4.在28 dpi,尿干扰素（interferon,IFN）γ,LIF及MIP-2与反映膀胱容量的尿斑参数相关。结论尽管小鼠的UTI模型具有很多复杂的相关因素,我们发现排尿行为和尿液炎性因子之间具有明显的相关性。我们的结果表明,尿液炎性因子对排尿行为的改变是具有统计学意义的,对其的深入讨论对理解UTI的急性及慢性病理机制都有重要意义。第二部分:小鼠慢性UTI模型中排尿行为变化原因的解剖学定位:膀胱还是肾脏?目的小鼠尿路感染模型中的排尿行为变化与尿液细菌负荷和部分炎性因子的表达正相关,尿液由肾脏产生,经输尿管贮存于膀胱,最终经尿道排出,途中经过多个解剖学器官。而尿路感染模型尿液中升高的炎性指标的来源并没有明确的解剖定位。我们收集感染4周后的小鼠肾脏和膀胱,并结合尿液变化分析,以期进一步明确细菌负荷及细胞因子/趋化因子的来源定位。方法我们对C57BL/6小鼠膀胱灌注尿路致病性大肠杆菌两次构建UTI模型,感染后第28天,对小鼠进行尿斑实验测定排尿行为变化。收集尿液,测定尿细胞因子/趋化因子含量。同日,小鼠被安乐死并收集其膀胱和肾脏,对组织的细菌负荷及炎性因子含量进行同样测定。用Spearman检验对感染后第28天的膀胱细胞因子与VSA各参数,膀胱细菌负荷与VSA各参数,肾脏细胞因子与VSA各参数,肾脏细菌负荷与VSA各参数,尿液细胞因子与膀胱或肾脏细胞因子进行相关性分析。结果在感染后第28天,14只小鼠中,8只发展为慢性膀胱炎,11只患有慢性肾盂肾炎。炎性因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage-colony-stimulation factor,GM-CSF）,干扰素 γ 诱导的单核细胞因子（monokine induced by gamma interferon,MIG）在尿液中与膀胱、肾脏中的表达同时具有正相关性;炎性因子RANTES,血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）在尿液中与膀胱中的表达具有正相关性;炎性因子eotaxin,G-CSF,MIP-1α,MIP-1β在尿液中与肾脏中的表达具有正相关性。主要尿斑（primary voiding spot,PVS）总数及尿斑总尿量与膀胱、肾脏的细菌负荷均相关;同时与膀胱及肾脏的 eotaxin,粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulation factor,G-CSF）,IL-6,IL-17,IP-10,角化细胞衍生趋化因子（keratinocyte-derived chemokine,KC）,LIF,MIG,MIP-2 和 TNFα 均呈正相关;与膀胱中RANTES,VEGF正相关;与肾脏中的单核细胞趋化蛋白1（monocyte chemoattractant protein 1,MCP-1）,M-CSF 及 MIP-1α 正相关;与肾脏中IL-2,IL-9,IL-10,IL-12（p40）及 IL-12（p70）负相关。膀胱 eotaxin,IP-10,MCP-1和MIP-1β与PVS平均尿量正相关。结论在慢性炎症模型中,尿频及多尿为主要排尿行为异常,与膀胱及肾脏的细菌负荷升高及泌尿系组织中eotaxin,G-CSF,IL-6,IL-17,IP-10,KC,LIF,MIG,MIP-2和TNFα升高具有相关性。导致慢性尿路感染中排尿行为改变的原因尚需更多的研究支持,而我们的结果可以为未来的研究提供一些思路。第三部分:小鼠UTI模型中早期尿IL-2及IL-10升高对慢性UTI易感性的预测作用分析目的与临床患者类似,构建尿路感染模型常用的C57BL/6小鼠具有强大的清除细菌的能力。单次细菌灌注在2周内基本完全清除,重复细菌灌注也仅有部分小鼠在4周的慢性尿路感染诊断时间节点表现为阳性。为了明确尿路感染早期的哪些因素可能与模型后期是否发展为慢性尿路感染相关,我们进一步探究了慢性尿路感染的特点及影响因素。方法我们对野生型雌性C57BL/6小鼠膀胱灌注尿路致病性大肠杆菌两次,间隔24h,以构建尿路感染模型。感染前对小鼠测量基线排尿行为。感染后第1、3、7、10、14、21、28天收集小鼠的尿液及排尿行为数据。在28 dpi,安乐死小鼠,收集其膀胱和肾脏组织。对1 dpi及28 dpi收集的尿液及膀胱、肾脏测定细胞因子/趋化因子。对1、3、7、10、14、21及28 dpi的尿液及膀胱、肾组织测定细菌负荷。根据4周的尿液整体CFU测定结果,将感染后所有检测节点内出现过至多一次尿液细菌负荷＜104 CFU/ml的小鼠定义为慢性UTI易感性小鼠,否则定义为抵抗性小鼠。结果1.在感染后第4周,64.3%的小鼠发展为慢性UTI易感小鼠,35.7%的小鼠为慢性UTI抵抗小鼠。2.在急性感染期的感染后第1天,易感的小鼠表现为较高的尿液细菌负荷、尿斑数量多、尿斑总尿量大。尿液IL-2（比值比（odds ratio,OR）11.9,95%置信区间（confidence interval,CI）1.1-130.8,p=0.043）及 IL-10（OR 14.0,95%CI 1.0-201.2,p=0.052）在 1 dpi 升高是慢性 UTI 的重要因素。3.在28 dpi,慢性UTI易感小鼠和慢性UTI抵抗小鼠之间的尿液/组织细菌负荷及部分炎性相关的尿液/组织细胞因子/趋化因子均有统计学差异。结论在我们构建的UTI模型中,感染后第1天尿液IL-2及IL-10升高的小鼠更有可能发展为慢性UTI。近期有很多关于IL-2及IL-10在UTI易感性方面的基础及临床研究可以多方面验证这一结论。未来对这两个因子的深入研究或可对难治的复发性UTI及慢性UTI的治疗提供更多帮助。第四部分:雌激素及雌激素受体β对小鼠慢性UTI的影响目的雌激素在感染疾病中的作用为“双刃剑”。在临床和基础研究层面,雌激素对UTI有抑制和促进的不同作用。我们从其结合位点之一,雌激素受体β入手,通过构建卵巢切除术（ovariectomy,OVX）及尿路上皮雌激素受体 β 过表达（urothelial estrogen receptor β-overexpressed,uERβ-OE）模型,在小鼠慢性UTI模型中对雌激素及其受体的作用进行探讨。方法我们首先构建了 C57BL/6为背景品系的雌性OVX小鼠及uERβ-OE小鼠。对14只10周龄C57BL/6野生型雌性小鼠及14只同龄OVX小鼠膀胱灌注UTI89 108 CFU/50μl,重复1次,间隔24小时,构建慢性UTI模型。收集其感染后第1、3、7、10、14、21及28天的尿液测定细菌负荷,尿斑实验结果测定排尿行为变化。在第28天,将小鼠安乐死,收集其膀胱及肾脏,测定组织细菌滴度。对ERβ作用的研究,我们将3-4月龄的雌性野生型小鼠6只,同窝阴性对照6只及uERβ-OE小鼠6只采取以上同样方式进行测定。结果1.在慢性UTI模型中,OVX小鼠的成模率、尿液和组织的细菌负荷均值较野生型低,但不具有统计学差异。尿斑实验不具有显著差异。2.在慢性UTI模型中,uERβ-OE小鼠的成模率、尿液和组织的细菌负荷均值较同窝阴性对照组高,与野生型小鼠相近,但均不具有统计学差异。尿斑实验不具有显著差异。3.OVX小鼠在10 dpi体重较野生型小鼠高,但可能主要受到OVX的影响;uERβ-OE小鼠的体重在感染后与其他两组不存在统计学差异。结论雌激素及雌激素受体β对小鼠慢性UTI的细菌负荷及排尿行为无显著影响。