论文部分内容阅读
目的:通过体外孵育反应体系,观察五种6,7-呋喃香豆素类化合物（补骨脂素、香柑素、异茴芹素、欧前胡素、异欧前胡素）对大鼠肝微粒体细胞色素P450（cytochrome P450, CYP）1A2和2E1活性的影响,并比较五种化合物作用的强弱,为指导临床合理用药和新药研制开发提供理论基础。方法:①采用健康成年雄性Wistar大鼠,利用CaCL2沉淀法制备大鼠肝微粒体,并常规测定大鼠肝微粒体蛋白含量、CYP总量和细胞色素b5（cytochrome b5, Cytb5）含量等指标。②以咖啡因和氯唑沙宗分别作为CYP 1A2和CYP2E1的探针药,以安替比林为内标,用高效液相色谱法同时检测体外反应体系中两种探针药浓度的变化,并进行方法学的考察。③体外反应体系由肝微粒体悬液、Tris缓冲液和辅助因子溶液组成,探针药经CYP代谢所需的NADPH由辅助因子溶液中的NADP+、G-6-PD、G-6-P、MgCL2等反应体系产生;并在体外37℃孵育时间、肝微粒体蛋白浓度和探针药浓度等三方面进行体外反应条件的优化,确定最佳反应条件。④在体外反应体系中五种6,7-呋喃香豆素类化合物和阳性对照药氯霉素的终浓度为1.0,2.0,4.0,8.0,16.0μg·mL-1,同时设立空白对照管/组;各管加入探针药后,置37℃水浴中孵育反应40min后加入冰冷氯仿液震荡,终止反应并萃取剩余的探针药;以HPLC法检测探针药的剩余量,计算探针药转化率;重复实验操作6次。以各组间探针药转化率的不同,评价五种试药对大鼠肝微粒体CYP1A2和2E1活性的影响。结果:①正常大鼠肝微粒体蛋白含量为18.265±2.72 mg·g-1 Liver wet, CYP总量和Cytb5含量分别为0.439±0.156、0.234±0.112 nmol·mg-1 Protein。②色谱条件:流动相为甲醇-水（30:70）,流速l.0mL·min-1,柱温25℃,紫外检测波长280nm,咖啡因、氯唑沙宗和内标物安替比林的色谱峰分离完全,滞留时间分别为3.81、21.50和6.25min。咖啡因在0.520.0μg·mL-1范围内线性关系良好（r=0.9998）,日内差的变异系数为≤5.26%,日间差的变异数为≤4.52%,低、中、高三个浓度的加样回收率为105.0%、96.4%、97.1%;氯唑沙宗在0.520.0μg·mL -1范围内线性关系良好（r=0.9995）,日内差的变异系数为≤5.91%,日间差的变异系数为≤1.90%,低、中、高三个浓度的加样回收率为96.0%、101.6%、96.2%。③体外反应体系的条件选择是:37℃孵育反应的时间为40min,微粒体的蛋白浓度为1.0mg·ml-1,咖啡因和氯唑沙宗的终浓度为8.0μg·ml-1。④在空白组中咖啡因和氯唑沙宗的平均代谢转化率分别为（63.8±5.1）%和（43.5±7.6）%,5个浓度的阳性对照药氯霉素均显著抑制两种探针药的代谢转化率（均P<0.05）,并呈良好的剂量依赖性。5种6,7-呋喃香豆素试药组两种探针药的代谢转化率均有不同程度的减少,除少数低浓度点以外,与空白组比较均有显著地统计学意义,在总体上呈现一定的量-效关系。在同等质量浓度下,与氯霉素相比较,异欧前胡素在2.0,4.0,8.0μg·mL-1浓度时咖啡因转化率低于氯霉素（P<0.05）;欧前胡素和香柑素在2.0,4.0,8.0μg·mL-1浓度时氯唑沙宗的转化率则显著小于氯霉素（ P<0.05）;异茴秦素在各浓度点两种探针药的转化率均高于氯霉素（P<0.05）。结论:①应用CaCl2沉淀法制备的大鼠肝微粒体能满足体外药物代谢研究的需要。②建立的以安替比林为内标,同时检测咖啡因和氯唑沙宗的反相高效液相色谱法,操作简便,灵敏、可靠,稳定性和重现性好。③5种6,7-呋喃香豆素化合物对大鼠肝微粒体CYP1A2和CYP2E1的活性呈剂量依赖性抑制作用。对CYP1A2的抑制作用表现为异欧前胡素>欧前胡素>补骨脂素≥香柑素>异茴芹素;对CYP2E1的抑制作用,为欧前胡素≥香柑素>异欧前胡素≥补骨脂素>异茴芹素。异欧前胡素对CYP1A2的抑制作用以及欧前胡素和香柑素对CYP2E1的抑制作用可能强于氯霉素,但是,异茴芹素对CYP1A2和CYP2E1的抑制作用明显弱于氯霉素。