近年来,自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)发病率口趋升高。AIH属于自身免疫性肝病(autoimmune liver diseases,AILD),是由自身免疫反应介导的严重的进行性疾病,许多患者可迅速进展为肝硬化和肝衰竭。对A1H作出快速而准确的诊断和治疗是阻止病程进展的关键因素。然而,由于该病发病机制未明,临床表现不典型及伴发重叠综合征等,目前AIH的诊断方法还存在过程繁杂、周期长、敏感性和特异性低等局限,因此探索建立AIH诊断新方法具有重要的临床应用价值。为此,本课题利用临床病例标本,采用代谢组学方法,通过1HNMR和LC-MS/MS Q-TOF检测,筛查AIH的诊断生物标志物；纳入临床常见、易混淆疾病原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)、重叠综合征(overlap syndromes OS)和药物性肝损伤(drug-induced liver injury, DILI),对比考察所选标志物在AIH诊断中的敏感性和特异性；通过中西医干预研究,考察标志物对预后的预示能力。主要研究内容和结论如下：1.建立了大样本AILD医学数据库(1866例),初步分析了三种自身免疫性肝病的主要临床特征。系统整理了解放军302医院2005-2010年AILD病历资料,建立了大样本的医学数据库,共收录1866例AILD患者信息,其中AIH676例、PBC912例、OS278例。AIH在2005-2010年住院人数比例从0.65%上升至0.96%,呈逐年升高趋势；三种自身免疫性肝病的临床症状／体征缺乏特异性,临床特征相似,主要表现为乏力、纳差、面色晦暗、黄疸、肝掌、肝功异常等,且患者做肝穿病理检查的比例较少,给临床诊断带来一定的困难。数据库的建立为各类AILD的流行病学研究提供数据支持。该数据的建立有利于AILD的中医证侯学研究,方便了临床和科研工作的开展。2.建立了基于血浆1HNMR代谢组学的AIH诊断模型。本文采用LC-MS/MS Q-TOF和1HNMR技术,以AIH、PBC及健康人群血浆、尿液样本为研究对象,对血浆、尿液中小分子代谢物质进行检测分析。结果显示：基于LC-MS/MS Q-TOF技术建立的血浆样本诊断模型的质量参数,R2Y=96.9%,Q2(cum)=71.9%,诊断模型可以较好地解释组间差异,但预测可信度较低；基于1H NMR技术建立的尿液样本诊断模型的质量参数R2Y=56.6%, Q2(cum)=9.6%,诊断模型不能很好地解释组间差异,并且预测可信度较低；基于1HNMR技术建立的血浆样本诊断模型的质量参数R2Y=99.4%,Q2(cum)=97.7%,诊断模型能很好地解释组间差异,并且预测可信度高。通过对上述诊断模型进行评价和比较,基于血浆的1HNMR代谢组学技术在AIH诊断中有潜在的优势。3.筛选获得了敏感性和特异性均较高的10个AIH诊断生物标志物。在已建立的基于血浆的1H NMR代谢组学的AHI诊断方法基础上,通过扩大样本量(65例),采用1802个化学位移进行建模分析,结果显示：模型质量参数R2Y=97.4%,Q2(cum)=85.6%,诊断模型仍能很好地解释组间差异,并且预测可信度高。考虑到临床实际操作性不强,采用多标准评价方法(multi-criteria assessment, MCA),首先从1802个化学位移中找出AIH与PBC组间区分贡献较大的256个化学位移,然后再经过不断剔除剩余变量,最终初步锁定61个化学位移,并采用61个化学位移建立诊断模型,模型质量参数R2Y=84.7%,Q2(cum)=80.4%,模型拟合良好。进一步指认了61个化学位移对应的10个标志物,它们分别是柠檬酸、谷酰胺、乙酰乙酸、丙酮酸、β-羟异丁酸、组氨酸、谷氨酸、肌酸酐、二甲胺和丙酮。当继续剔除任意1个标志物后,所建立的诊断模型质量参数R2y和Q2(cum)均显著下降,达不到有效诊断的要求。4.考察了所选10个标志物在临床诊断中的实际应用。本部分实验扩大疾病种类考察所选10个标志物在临床AIH诊断中的应用,结果显示：在AIH与PBC、OS、药物性肝损伤(drug-induced liver injury,DILI)的诊断中,诊断模型的敏感性为90.5%,特异性为98.3%,准确率为96.2%；模型在诊断AIH和DILI时敏感性为95.0%,特异性为100%,准确率为97.4%；模型在诊断AIH和PBC时敏感性和特异性均为100%,准确率为100%;模型在诊断AIH和OS时敏感性为100%,特异性均为95.0%,准确率为97.3%。验证了所选标志物在AIH的诊断中重现性较好,而且在疾病诊断时,具有较高的敏感性和特异性。4.通过考察中药愈肝方颗粒联用免疫抑制剂(泼尼松)对所选生物标志物的干预效应,验证了所选AIH临床诊断生物标志物能较好地预示病情的预后能力。针对AIH诊断血清抗体缺乏特异性、不能预示疾病预后的问题,本研究选择临床用于AIH治疗的愈肝方颗粒(302医院院内制剂)和泼尼松为干预药物,通过临床研究验证所选生物标志物在中西医治疗中的变化趋势,结果显示：从治疗前后代谢物的含量变化和AIH患者代谢模式随时间变化的PCA轨迹图观察,显示了所选生物标志物能较好地预示病情的预后;与单用泼尼松相比,愈肝颗粒联用泼尼松对AIH有更好的治疗效果,尤其在降低转氨酶、改善症状和提高生活治疗方面作用突出。综上,本研究首次建立了一种基于1H NMR检测的AIH诊断新方法,在严格控制实验条件的情况下,具有较好的稳定性和重现性。并且该方法在AIH的诊断中具有较高的敏感性、特异性以及准确性,能有效区分PBC/OS/DILI三种临床常见的易混淆疾病。同时,诊断生物标志物可以较好地预测疾病的预后。本研究为探寻AIH诊断新方法提供了一种新思路和技术支持,显示了其潜在的应用前景。