莲藕(Nelumbo nucifera Gaertn.)是莲科多年生植物莲的肥厚根茎,不仅营养价值丰富,而且具有较好的保健功能。中国的莲藕品种多样,拥有丰富的资源,具有广阔的发展前景。但是,由于新鲜的莲藕易发生褐变,不耐贮藏,因此,在一定程度上限制了产品的生产和销售。研究表明,多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是一种在果蔬中普遍存在的氧化还原酶,可导致组织的酶促褐变,而且PPO的活性与植物抗病虫害有关。目前,有关PPO导致莲藕褐变的具体作用过程,以及PPO参与抗逆境胁迫时的作用机制等方面都尚不明确。因此,本试验以莲藕为材料,在前期实验室研究的基础上,选用酵母双杂交方法筛选与莲藕PPO互作的蛋白,利用酵母回转验证是否互作,推测PPO与这些蛋白的互作调控方式等,以期利用互作蛋白来调控PPO的活性,在植株的不同时期选择性降低或增加PPO的表达,为解决莲藕褐变问题及增强植物抗逆性提供理论基础。本试验主要研究结果如下:1.根据NCBI数据库公布的莲藕PPO基因序列(GenBank:FJ999635.1),构建了莲藕PPO的诱饵表达载体pGBKT7-PPO和pGBKT7-JD-PPO(去除导肽);诱饵蛋白毒性与自激活检测结果表明,诱饵蛋白PPO对酵母Y2H Gold无毒性且无自激活作用,不能激活该酵母的GAL4系统,可用于文库筛选。2.采用酵母双杂(Y2H)技术从莲藕cDNA文库中筛选与PPO互作的蛋白,筛出的菌落总数目为1.95×10~6cfu/mL,杂交效率为8.89%,表明酵母具有良好的杂交状态。经过三轮筛选,在QDO/X/A上初步筛出48个蓝色阳性克隆,在NCBI上BLAST比对测序结果,最终得到了28个与PPO具有相互作用的候选蛋白。对这些候选基因的功能进行分析归类,发现其编码蛋白主要包括抗病防御、抗氧化、电子传递、发育调控类、酚酸类合成、乙烯合成和一些功能未知蛋白等。3.PCR扩增需验证的一些关键基因,重建猎物(prey)表达载体,并与诱饵质粒pGBKT7-JD-PPO共转入Y2H Gold酵母中,进行回转酵母验证。结果表明,其中4个候选基因:金鱼草素合酶(aureusidin synthase-like)、半胱氨酸脱硫酶(cysteine desulfurase)、NADH脱氢酶、GLK1转录因子与PPO在酵母Y2H Gold体内有互作。4.构建亚细胞定位载体p35S-PPO-eGFP,利用冻融法将p35S-PPO-eGFP质粒转入GV3101农杆菌中。使用农杆菌介导法,在本氏烟草叶中瞬时表达PPO,在激光共聚焦显微镜下观察叶片表皮中的荧光信号,图片分析发现,莲藕叶片中PPO定位在叶绿体中,莲藕中PPO可能定位于质体中。5.利用相关生物学网站分析PPO的理化性质,莲藕PPO的相对分子质量约为67.2kD,为亲水性蛋白质,且无跨膜区。对莲藕PPO基因家族构建系统进化树,发现莲藕PPO与毛茛科中蓝花耧斗菜亲缘关系最近,与桑科中鲁桑和川桑、蔷薇科中苹果和梨等物种间的亲缘关系相对于其他植物较近。