研究目的可吸入颗粒物作为目前大气环境的首要污染物,其对人类健康的危害尤其是对心血管系统影响越来越受到关注。WHO数据显示,全世界每年因细颗粒物(PM2.5)污染可造成至少80万人死亡和640万失能调整生命年(DALY)的损失,且65%发生在PM2.5污染较严重的亚洲国家(中国和印度)。由于城市经济发展模式和以煤炭为主能源结构的差异,中国呈现出煤烟和燃油复合型污染的特征,但仍以燃煤污染为主。而燃煤排放的颗粒物以细颗粒为主,目前关于大气细颗粒物对呼吸系统毒性的研究较多,但有关单种燃煤源PM2.5对心血管影响的研究还比较有限。为进一步了解细颗粒物不同组分在心血管系统损伤中的影响,本实验结合燃煤排放PM2.5元素和离子分析探寻PM2.5致心血管毒性的优势成分；通过比较燃煤PM2.5不同组分对人脐静脉血管内皮细胞EA.hy926的增殖毒性及氧化损伤,研究PM2.5对心血管的直接毒性影响,探讨PM2.5和内皮功能之间的关联,为后续探索PM2.5致心血管毒性的机制研究提供体外实验数据。研究方法1.细胞选择及培养人脐静脉内皮细胞被广泛用于内皮功能的研究。HUVEC原代培养较为耗时,且易出现杂细胞的污染,传2～3代后细胞就开始衰退,难以长期维持。EA.hy926是和A549融合的人脐静脉内皮细胞株,是目前内皮功能体外研究中最为认可的细胞株。将冻存的EA.hy926细胞移入于含20%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养液中,在37℃、5%CO2条件下培养复苏。待细胞达到80%融合时,以0.25%胰酶消化,1：2传代,用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养液,在37℃、5%CO2条件下传代培养至对数生长期。2.燃煤PM2.5采集及组分提取选择大同散煤为样煤,利用固定源稀释通道采集燃煤PM2.5,超声提取燃煤PM2.5全颗粒物和无机组分,索氏提取有机组分,并配制成100、250、500、1000、2000μg/mL染毒母液,-20℃保存备用。3.细胞毒性检测采用MTS法检测燃煤PM2.5不同组分对EA.hy926细胞毒性影响。根据预实验结果,对人脐静脉内皮细胞EA.hy926染毒24h,设置10、25、50、100、200μg/ml五个剂量组,全颗粒物和无机组分以PBS为溶剂对照,有机组分以DMSO为溶剂对照,分别于染毒结束前1小时加入MTS(优于MTT的新型四唑化合物,检测原理与MTT相同),1小时后用酶标仪测吸光度值(OD)。4.氧化损伤检测将大同燃煤PM2.5不同组分对EA.hy926进行染毒24h,选择氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)及炎性因子(NO)。按试剂盒要求用可见分光光度计测定细胞中氧化损伤指标的含量。研究结果1燃煤PM2.5排放因子测定1.1燃煤PM2.5可溶性离子含量排放分析大同散煤燃烧排放PM2.5可溶性离子含量测定：SO42-含量最高,另外Cl、NO3、Na、NH4、K含量也较高。1.2燃煤PM2.5的元素排放因子分析大同散煤燃烧排放PM2.5中元素含量的变化：Al、Fe、K、Na、S、Zn等常量元素含量较高,且As、B、Co、Cr、Ni、Pb等痕量重金属元素含量也有不同程度的分布。2细胞毒性测定结果2.1不同组分的剂量效应毒性燃煤PM2.5全颗粒物、无机组分及有机组分对EA.hy926细胞活性均具有抑制作用,细胞存活率随染毒剂量增加而下降,与溶剂对照组相比,差异具有统计学意义。2.2相同剂量下各组分细胞毒性的比较燃煤PM2.5细胞毒性从大到小排列为有机组分>无机组分>全颗粒物,但无机组分细胞毒性虽具有高于全颗粒物的趋势,差异无统计学意义。3细胞氧化损伤指标测定结果3.1超氧化物歧化酶(SOD)燃煤PM2.5各组分对EA.hy926细胞染毒24h后,随着染毒剂量的增加,细胞上清液中SOD活力均下降,且与对照组相比差异显著。相同剂量组比较,燃煤PM2.5各组分抑制SOD活力程度依次为：有机组分>无机组分>全颗粒物,相同剂量组不同组分间的比较均有统计学差异。3.2丙二醛(MDA)和溶剂对照相比,燃煤PM2.5全颗粒物、无机组分和有机组分分别对EA.hy926细胞染毒后,随着染毒剂量的增加,细胞上清液中MDA含量分别有不同程度的增加,且与对照组相比差异显著。燃煤PM2.5各组分所致的MDA含量大小存在低剂量组有机组分>全颗粒物>无机组分,高剂量组全颗粒物>无机组分>有机组分趋势,且具有统计学意义。从上述结果可以看出,随着剂量增加,全颗粒物和无机组分引起MDA含量明显增加,而有机组分则变化趋于平缓。3.3谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和溶剂对照相比,燃煤PM2.5全颗粒物、无机组分和有机组分分别对EA.hy926细胞染毒后,随着染毒剂量的增加,细胞上清液中GSH-Px活力分别下降,各剂量组与溶剂对照组比较均有统计学差异。相同剂量下,燃煤PM2.5各组分引起GSH-Px活力下降程度基本具有无机组分>有机组分>全颗粒物的趋势,但统计学意义不显著。3.4过氧化氢酶(CAT)和溶剂对照相比,燃煤PM2.5全颗粒物、无机组分和有机组分分别对EA.hy926细毒后,随着染毒剂量的增加,细胞上清液中CAT活力均下降,且各剂量组与溶剂对照组比较均有统计学差异。燃煤PM2.5各组分对CAT抑制程度具有无机组分>有机组分>全颗粒物的趋势,但统计学意义不明显。3.5一氧化氮(NO)和溶剂对照相比,燃煤PM2.5全颗粒物、无机组分和有机组分分别对EA.hy926染毒后,随着染毒剂量的增加,细胞上清液中NO含量均上升,各剂量组与溶剂对照组比较均有统计学差异。相同剂量下,燃煤PM2.5各组分染毒后NO含量大小为全颗粒物>无机组分>有机组分,且具有统计学意义。研究结论1、燃煤PM2.5不同组分(全颗粒物、无机组分、有机组分)均对血管内皮细胞EA.hy926具有明显的细胞活性抑制作用且存在剂量反应关系；且有机组分的细胞毒性显著高于全颗粒物和无机组分,而无机组分和全颗粒物无统计学意义上的差别。2、燃煤PM2.5不同组分均对血管内皮细胞EA.hy926氧化损伤作用明显,SOD、GSH-Px、CAT等抗氧化酶的活性降低,MDA和NO含量增加。3、燃煤PM2.5不同组分对EA.hy926细胞毒性和氧化损伤结果之间的差异可能与PM2.5组分相关,燃煤PM2.5引起血管内皮细胞氧化损伤机制仍需进一步研究。