动物腹泻病是指由细菌、病毒感染或其他各种因素引起的以急性或慢性腹泻为主要特征的疾病。该病多发生于幼龄动物中,严重威胁畜牧业的健康发展。而产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic escherichia coil,ETEC)又是动物腹泻的主要致病因素,ETEC可产生一种或几种肠毒素,包括热敏肠毒素(Heat-liable toxin,LT)和耐热肠毒素(Heat-stable toxin,ST),通过影响肠细胞壁的透过性,使水和电解质流向肠腔,从而导致类似人霍乱的水样腹泻的发生。ST为小分子蛋白,因其具有较好的免疫原性,常被用于疫苗研发。LT则凭借分子量大、免疫原性强等优势,常被用作黏膜免疫佐剂。微生态制剂(Probioties),是指运用微生态学原理,将益生菌及其代谢所产生的促生长物质进行特殊加工而制成的活菌制剂。畜禽微生态制剂已经逐渐成为社会的研究焦点,因为其有别于化学物质具有无毒副作用(非化学物质)、药残检测无残留、对抗生素等药物无耐受能力等优点。目前,抗生素的使用已受到严格控制,使微生态制剂广泛应用于食品,药品及保健食品等多个领域,且应用效果显著。酵母细胞表面展示技术是一种将外源靶蛋白通过信号肽引导,进而锚定在酵母细胞表面的真核表达系统。酿酒酵母菌是常用的展示载体。此项技术具有表达偏差小、展示蛋白种类多、分子数量大、筛选、纯化、活性测定方便等特点。目前,该技术已应用于多个研究领域,具有广阔的应用前景。近年来,抗生素的过度使用也给动物体和周围环境造成较高浓度的兽药残留,破坏了水及土壤等生态环境。耐药菌株的出现成为传统抗生素使用的一大障碍。因而针对特异性靶点设计安全性好、免疫原性高的新型微生态制剂已成为当前研究的热点。本课题成功建立了大肠杆菌肠毒素融合蛋白在酵母表面的展示技术,实验研究表明,构建的酿酒酵母基因工程菌不仅具有微生态调节作用,还可以有效提高机体的黏膜免疫功能,对强毒ETEC的攻击具有保护作用。1、酿酒酵母表面展示系统的建立。首先,进行ETEC所产生的三种肠毒素est A、estB及eltAB基因的克隆。采用基因定点突变的方法对estA及eltAB基因进行改造,然后以7个氨基酸的linker序列将三种肠毒素基因串联。通过双酶切、连接、转化等手段成功构建pYD1-estA-eltAB-estB重组质粒,再经电击转化的方式成功构建了EBY100/pYD1-estA-elt AB-estB酿酒酵母基因工程菌,免疫荧光检测及扫描电镜检测结果显示,estA-elt AB-estB融合蛋白成功展示在酿酒酵母菌表面。2、酿酒酵母基因工程菌对大鼠小肠上皮细胞的影响。选取4-6周龄的SPF级SD大鼠90只,雌雄各半。随机分为空白对照组、基因工程菌组及EBY100酵母菌组,每组30只。EBY100酵母菌组及基因工程菌组的灌胃浓度为107CFU/mL,每天灌胃1次,每次2m L/只,空白对照组给予同等体积的生理盐水,持续21d。此后连续3 d灌胃108 CFU/mL大肠杆菌H10407菌液,每日一次,每次4m L/只。分别于灌胃试验第7d、14d、21d及灌胃大肠杆菌菌液3d后取所需组织样本。(1)基因工程菌对小肠绒毛影响。酵母及其基因工程菌的十二指肠宽度极显著高于空白对照组(P<0.01),且两实验组之间无显著差异(P<0.05)。酵母基因工程菌组的十二指肠、空肠的绒毛宽度极显著高于空白对照组(P<0.01),十二指肠的V/C值明显高于EBY100酵母菌组,呈现出极显著差异(P<0.01),回肠及空肠的隐窝深度则显著低于于空白对照组(P<0.05),绒毛长度及宽度变大,隐窝深度减小是小肠对营养物质消化吸收能力增强的表现,这也进一步证明了酿酒酵母基因工程菌对小肠绒毛的生长促进作用。从灌胃大肠杆菌后的测量结果可以看出,EBY100酿酒酵母组十二指肠、空肠及回肠的长度及V/C值呈极显著下降趋势(P<0.01),隐窝深度呈现明显上升趋势,其中空肠的隐窝深度数值较灌胃前变化最大,呈现出极显著差异(P<0.01)。EBY100酵母菌组绒毛长度、V/C值及较灌胃大肠杆菌之前极显著下降(P<0.01),空肠的隐窝深度极显著上升(P<0.01)。酵母基因工程菌组中空肠及十二指肠绒毛长度则无明显变化(P>0.05);在绒毛宽度及隐窝深度方面各长度均表现出无显著变化(P>0.05);十二指肠的V/C值较灌胃ETEC前无显著差异(P>0.05)。ETEC攻毒后结果说明,与EBY100酵母菌相比较,酵母基因工程菌对小肠绒毛的保护作用更强。(2)粪便pH值检测。实验的0-21d期间,空白组pH值均高于实验组,并从灌胃的第14d开始,酵母及其基因工程菌组的pH值极显著低于空白对照组(P<0.01),灌胃21d时差异最显著(P<0.01)。灌胃ETEC后,空白对照组肠道内pH值显著升高(P<0.05);EBY100酵母菌组的pH值与灌胃21d相比并无显著变化(P>0.05);酵母基因工程菌组的pH值与灌胃21d相比基本无变化(P>0.05)。以上结果表明,酵母基因工程菌在维持肠道内酸碱平衡方面发挥了作用。(3)大鼠肠道菌群的变化分析。从灌胃的第14d开始,各实验组肠道菌群的数量开始显著增长,21d天时呈现出极显著差异(P<0.01)。其中,EBY100酵母菌组除肠球菌外肠道内的乳酸菌、双歧杆菌、梭菌及类杆菌的增长倍数均最大。当灌胃了ETEC后,酵母基因工程菌组大鼠肠道菌群数量的增长倍数极显著高于EBY100酵母菌组(P<0.01),这一结果也进一步证明了酿酒酵母基因工程菌对肠道菌群的调节作用。3、酵母菌及其基因工程菌的实验动物免疫研究。(1)酵母基因工程菌对大鼠肠黏膜中SIgA含量的影响。灌胃第14d,酵母工程菌组SIgA分泌量最高,与EBY100酵母菌组及空白对照组之间均呈现极显著差异(P<0.01);灌胃第21d,酵母工程菌组与EBY100酵母菌组均极显著高于空白组且两实验组之间无显著差异(P>0.05)。ETEC攻毒后空白对照组与实验组的SIgA的分泌量均极显著低于攻毒前(P<0.01),但酵母基因工程菌组减少的幅度最小,这说明酵母基因工程菌提高了小肠黏膜的免疫功能。(2)酵母基因工程菌对大鼠肠黏膜中细胞因子的影响。在实验初期,各实验组肠黏膜IL-2、IL-4及IFN-γ三种细胞因子含量均未发生显著变化,从灌胃第14d开始,EBY100酵母菌组及基因工程菌组各细胞因子含量显著上升(P<0.05);第21d时,呈现极显著上升趋势(P<0.01)。灌胃ETEC后,EBY100酵母菌组及基因工程菌组三种因子的分泌量均极显著高于21d空白对照组,其中,基因工程菌组IL-2、IL-4分泌量最高,而IFN-γ的分泌量最低,以上结果表明酵母基因工程菌有效的提高肠黏膜中IL-2、IL-4及IFN-γ的分泌量,从而提高机体免疫力。(3)酵母基因工程菌对大鼠免疫器官的影响。灌胃14d开始空白对照组及两组实验组的胸腺及脾脏系数均有所增加,其中酵母菌组增长幅度最小且明显低于基因工程菌组。灌胃ETEC后,空白组与酵母菌组数值均有所下降,而酵母基因工程菌组的数值并无明显变化,甚至有微小上升,与空白对照组形成显著差异(P<0.05)。这一结果表明,酵母基因工程菌具有促进胸腺及脾脏发育的功能。(4)酵母基因工程菌对大鼠血清学指标的影响。通过对血清中ALT、AST、TG、TBILI、DBILI、GLU、CHO、ALB及TP含量的检测可以发现,在实验的前21d,各实验组的各项指标的检测结果均无显著变化,但灌胃ETEC后,各组的ALB、TP及GLU值均呈现上升趋势,但均未达到显著水平。其中,酵母基因工程菌组上升幅度最小,这一结果表明,酵母基因工程菌没有引起肝组织的损伤及血液其他指标的改变。综上所述,得出以下结论:1、成功建立了大肠杆菌肠毒素在酿酒酵母表面的展示技术,动物实验证明,所构建的工程菌对大鼠安全、无毒副作用。2、酿酒酵母基因工程菌能有效降低攻毒ETEC后的大鼠肠道pH值,可以维持肠道内酸碱平衡。3、工程菌能够调节大鼠肠道微生态的动态平衡,使肠道菌群数量呈极显著上升趋势;ETEC攻毒后工程菌发挥酵母菌的益生作用,使肠道菌群数量依然实现稳定增长。4、工程菌可以提高肠道黏膜免疫力,增加SIgA、IL-2、IL-4及IFN-γ的分泌量;当强毒ETEC侵入时,可有效保护小肠黏膜不受侵害。