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研究背景骨肉瘤(Osteosarcoma,OSA)是一种由骨间质细胞发展而来,常发病于青少年的恶性肿瘤。其恶性程度高,易转移且预后差。长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类长度大于200个核苷酸的RNA转录物。由于其缺少开放阅读编码框(Opening reading frame,OFR),故不能编码蛋白。近年来,许多文献报道lncRNAs能够在多种人类肿瘤中发挥调控作用。结肠癌相关转录因子2(Colon cancer-associated transcript 2,CCAT2)是一种新近发现的lncRNA,在多种肿瘤中表现促进肿瘤生长的作用。研究目的本研究旨在探究CCAT2是否参与骨肉瘤发生发展,以及可能涉及miR-200b的内在调控机制。实验首先检测CCAT2和miR-200b在骨肉瘤组织及相应的癌旁组织样本,以及骨肉瘤细胞及人正常成骨细胞中的表达。随后分析沉默CCAT2后,骨肉瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的改变。研究方法首先收集骨肉瘤组织样本及相应的癌旁组织样本,并培养人骨肉瘤MG63,U20S,US732,Saos-2细胞及人正常成骨hFOB1.19细胞,采用qRT-PCR技术检测CCAT2和miR-200b的表达水平。随后通过转染si-CCAT2构建CCAT2低表达的MG63和U20S细胞,采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)实验,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU)掺入实验,FITC-Annexin V/PI凋亡检测实验,划痕实验和侵袭小室实验分别检测CCAT2沉默对MG63和U20S细胞活力、增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并采用蛋白质免疫印迹实验(westen blot)评估CCAT2沉默对MG63和U20S 中周期蛋白 D1(Cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶 6(Cyclin-dependent kinase 6,CDK6)、Bcl-2、Bax和Caspase 3在蛋白水平表达的影响。结果qRT-PCR实验结果表明,与癌旁组织相比,骨肉瘤组织具有高的CCAT2表达水平(P<0.001),而miR-200b在骨肉瘤组织中表达量明显降低(P<0.01);与人正常成骨Hfob1.19细胞相比,CCAT2在骨肉瘤MG63、U20S、US732和Saos-2细胞中高表达(P<0.05 或<0.01),而 miR-200b 在骨肉瘤 MG63、U20S、US732 和 Saos-2 细胞中低表达(P<0.05或<0.01)。si-CCAT2转染显著沉默了 CCAT2在MG63和U20S细胞中的表达(P<0.01)。CCK-8实验结果表明CCAT2沉默明显降低了 MG63和U20S细胞活力(P<0.05)。BrdU掺入实验结果表明CCAT2沉默显著阻碍了 MG63和U20S细胞增殖(P<0.05或<0.01),这伴随着Cyclin D1和CDK6蛋白表达水平的下降(P<0.05或<0.01)。FITC-Annexin V/PI凋亡检测实验结果表明CCAT2沉默明显诱导MG63和U20S细胞凋亡(P<0.01或<0.001),这伴随着Bcl-2蛋白水平的下降(P<0.05或<0.01)和Bax、Cleaved-caspase 3蛋白水平的上升(P<0.01或<0.001)。划痕实验和侵袭小室实验结果说明CCAT2沉默明显减少了 MG63和U20S细胞迁移和侵袭(P<0.01)。结论1.在骨肉瘤细胞中,CCAT2为高水平表达,而miR-200b为低水平表达。2.CCAT2沉默降低MG63和U20S细胞活力,限制细胞增殖,迁移和侵袭,并且促进细胞凋亡。研究目的微小RNA(microRNAs,miRNAs)是细胞内的另一类RNA转录物,长度约为20-25个核苷酸,同样不编码蛋白。LncRNAs通常通过改变miRNAs在肿瘤细胞中的表达水平来发挥调控作用。先前的文献已证实过表达miRNA-200b(miR-200b)能够抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭。然而,CCAT2是否参与骨肉瘤发生发展,以及CCAT2是否能够调节骨肉瘤中miR-200b表达尚不清楚。研究目的以CCAT2对miR-200b的调控关系为切入点,探讨miR-200b是否参与CCAT2对骨肉瘤细胞增殖,凋亡,迁移,侵袭的影响。最后研究miR-200b的可能分子靶标。研究方法首先采用qRT-PCR技术检测沉默CCAT2对MG63和U20S中miR-200b表达的影响。随后通过转染miR-200b inhibitor构建miR-200b沉默的MG63和U20S细胞,采用BrdU掺入实验,FITC-Annexin V/PI凋亡检测实验,划痕实验和侵袭小室实验分别检测miR-200b沉默对CCAT2沉默引起的MG63和U20S细胞增殖下降,凋亡增加,迁移和侵袭抑制的影响。利用westen blot实验评估Cyclin D1、CDK6、Bcl-2、Bax和Caspase 3在蛋白水平的表达。最后,采用westen blot实验和荧光素酶报告基因实验分析miR-200b与血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在 MG63 和 U20S 细胞中的关系。结果qRT-PCR实验结果表明CCAT2沉默显著提高了 MG63和U20S细胞中miR-200b的表达水平(P<0.05或<0.01)。BrdU掺入实验结果表明与单独CCAT2沉默组相比,miR-200b inhibitor转染显著促进了 MG63和U20S细胞增殖(P<0.05),这伴随着Cyclin D1和CDK6蛋白表达水平的上升(P<0.05)。FITC-Annexin V/PI凋亡检测实验结果表明miR-200b inhibitor转染明显缓解了 CCAT2沉默引起的MG63和U20S细胞凋亡增加(P<0.05)。与单独CCAT2沉默组相比,miR-200b inhibitor转染提升了 MG63和U20S细胞中Bcl-2的蛋白水平(P<0.05),同时降低了 Bax和Cleaved-caspase 3的蛋白水平(P<0.05)。划痕实验和侵袭小室实验说明miR-200b inhibitor转染同样减弱了CCAT2沉默引起的MG63和U20S细胞迁移和侵袭能力的下降(P<0.05)。此外,western blot结果表明CCAT2沉默明显降低了 MG63和U20S细胞中VEGF的蛋白水平(P<0.01),而miR-200b inhibitor转染缓解了 CCAT2沉默引起的VEGF蛋白水平下降(P<0.05)。荧光素酶报告基因实验结果表明同时转染miR-200b mimic和野生型的VEGF报告基因质粒显著抑制了荧光素酶强度(P<0.01)。结论1 CCAT2沉默能够提高miR-200b在MG63和U20S细胞中的表达水平。2沉默miR-200b在MG63和U20S细胞中的表达能够缓解CCAT2沉默对MG63和U20S细胞增殖,凋亡,迁移和侵袭的影响。研究背景探究CCAT2对骨肉瘤发生发展中的影响,并分析可能涉及miR-200b的内在分子机制,能够为骨肉瘤的诊断和治疗提供潜在的分子靶标。研究目的CCAT2沉默及miR-200b沉默敲低对骨肉瘤细胞中磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶 B(Protein kinase B,AKT)信号通路及腺苷酸激活蛋白激酶(Adenine monophosphate activated protein kinase,AMPK)信号通路的影响研究方法采用 westen blot 实验检测 CCAT2 沉默和 miR-200b inhibitor 转染后,MG63 和 U20S细胞中总的PI3K、磷酸化的PI3K、总的AKT、磷酸化的AKT、总的AMPK和磷酸化的AMPK蛋白表达水平,以分析CCAT2沉默和miR-200b inhibitor转染对MG63和U20S细胞中PI3K/AKT信号通路和AMPK信号通路的影响。结果Western blot实验结果表明CCAT2沉默通过降低磷酸化的PI3K与总的PI3K的表达比例(p/t-PI3K,P<0.05),磷酸化的AKT与总的AKT的表达比例(p/t-AKT,P<0.05或<0.01),以及磷酸化的AMPK与总的AMPK的表达比例(p/t-AMPK,P<0.01)显著抑制MG63和U20S细胞中PI3K/AKT和AMPK信号通路的激活。miR-200b inhibitor转染通过提高 p/t-PI3K(P<0.05 或<0.01)、p/t-AKT(P<0.05)以及 p/t-AMPK(P<0.05)的表达水平显著减弱了 CCAT2沉默对MG63和U20S细胞中PI3K/AKT和AMPK信号通路的抑制。结论CCAT2沉默能够通过上调miR-200b表达失活MG63和U20S细胞中PI3K/AKT和AMPK信号通路。