【摘 要】
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人参皂苷F2是一种四环三萜类稀有皂苷,具有多种生物活性,如抗癌、抗炎、抗氧化等。与其他稀有皂苷相比,F2具有更高的水溶性和生物膜渗透性,因此更易被人体吸收利用,具有重要的药用价值。由于F2天然含量少,化学合成难,因此本文拟构建生产F2的酿酒酵母细胞工厂,实现F2的异源高效生物合成。本文以高产原人参二醇PPD的酿酒酵母菌株WLT-MVA5为出发菌株,通过表达糖基转移酶UDP-glycosyltran
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人参皂苷F2是一种四环三萜类稀有皂苷,具有多种生物活性,如抗癌、抗炎、抗氧化等。与其他稀有皂苷相比,F2具有更高的水溶性和生物膜渗透性,因此更易被人体吸收利用,具有重要的药用价值。由于F2天然含量少,化学合成难,因此本文拟构建生产F2的酿酒酵母细胞工厂,实现F2的异源高效生物合成。本文以高产原人参二醇PPD的酿酒酵母菌株WLT-MVA5为出发菌株,通过表达糖基转移酶UDP-glycosyltransferase 1（UGT1）和glycosyltransferase yoj K1（GTK1）,对PPD的C3-OH和C20-OH进行糖基化修饰,在酿酒酵母体内构建了F2的生物合成通路,产量达到6.26 mg/L。随后对糖基转移酶进行了融合表达,并改造酿酒酵母内源途径,敲除DGA1并过表达DGK1使磷脂酸更多地流向三萜途径,敲除EGH1减少糖苷键的水解,高表达PGM1和UGP1提高UDPG的供应,提高F2的产量至56.31 mg/L。继而对限速糖基转移酶GTK1进行了半理性设计和定向进化,获得体外催化活性提高的糖基转移酶突变体GTK1F81W/F178S,将其转入酿酒酵母底盘,提升产量至86.80 mg/L,PPD到F2的转化率达到40.76%。最后,经过发酵条件优化和过程控制,在5 L发酵罐中F2的产量达到375.38mg/L。本研究对酿酒酵母进行工程改造,实现了F2的高产量异源合成,为F2的大批量生产及应用奠定了基础。
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