目的：铁是维持正常细胞功能必不可少的物质。多种恶性肿瘤表现出对铁的需求增加,可能是铁可以作为某些蛋白质的辅助因子参与维持细胞的生长和增殖。Ferroportin又被称为溶质转运蛋白家族40成员1。Ferroportin主要表达在网状造血系统、十二指肠、脾脏、肝脏、肾脏和心脏,胚胎外胚层也有表达。这些系统和铁代谢密切相关。亚细胞定位表明,Ferroportin主要表达在细胞膜和细胞质,包括肝细胞、肾小球上皮细胞、巨噬细胞、十二指肠上皮细胞。Ferroportin主要功能为将细胞内的铁输送到细胞外,参与铁的吸收和维持铁代谢的平衡。但Ferroportin只是负责将细胞内的铁输送到细胞外,而细胞外的铁进入细胞则是其他蛋白质负责。Ferroportin是体内铁代谢的关键所在,Ferroportin的表达高低控制着细胞内铁水平的高低。Ferroportin表达水平受到至少三个机制调控：转录水平调控；翻译水平调控；蛋白水平调控,特异性的和铁调素hepcidin结合,使ferroportin降解。其中hepcidin是目前唯一被证实的Ferroportin的配体,hepcidin和Ferroportin结合后使ferroportin磷酸化而介导ferroportin内化,并通过蛋白酶降解。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是一种恶性程度很高的肿瘤,是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一。我国的肝细胞癌的发病率在恶性肿瘤发病率中排名第四,为每十万人口约为23.5例,而死亡率居恶性肿瘤死亡率的第2位。加之HBV和HCV感染的不断发展,HCC的发病率在西方国家也在不断增长。到目前为止,很多研究均显示HCC中存在许多基因畸变表达。Ferroportin在肝细胞高水平表达,肝脏又是铁代谢的关键器官。本研究通过检测临床病例标本中Ferroportin蛋白在肝细胞癌患者中的表达水平；进一步通过细胞生物学实验研究分析Ferroportin蛋白和肝癌细胞恶性行为的关系,同时通过分子生物学的实验研究其具体分子机制；从而初步阐明Ferroportin蛋白在肝细胞癌发生发展过程中的机制及其意义。方法：采用免疫组织化学染色检测60例HCC的在组织、癌旁肝组织和10例正常肝组织样本中Ferroportin的表达水平及分析Ferroportion的表达水平与HCC患者临床病理学特征的关系。进一步通过构建稳定过表达细胞株,提高了肝癌细胞株MHCC-97H的Ferroportin蛋白的表达；运用生长曲线、MTT实验、划痕实验、基质胶侵袭实验研究Ferroportin蛋白对高转移肝癌细胞生物学行为的影响,及采用荧光测量法检测了Ferroportin对细胞可变铁池(LIP)的影响。最后通过荧光定量PCR和Western-blot证实了Ferroportin在肝癌细胞中低表达的原因。结果：免疫组织化学检测结果显示：(1)Ferroportin在正常肝组织、癌旁组织的细胞质和细胞膜都表现出强阳性表达。而在大多数肝细胞癌组织只有一小部分呈弱阳性。统计分析HCC组织内的Ferroportin蛋白表达阳性率和评分分别为28.3%(17/60)、0.96±0.31；在癌旁组织中Ferroportin蛋白表达阳性率和评分分别为91.17%(55/60)、5.97±2.12；在正常肝组织中Ferroportin蛋白表达阳性率和评分分别为100%(10/10)、6.38±2.59。(2)统计分析60例HCC患者的Ferroportin的表达水平与其临床病理学特征的关系显示：肝癌伴有肝内转移的Ferroportin蛋白表达阳性表达率和阳性评分分别为16.67%,0.69±0.33；不伴有肝内转移其阳性表达率和阳性评分分别为31.25%,1.03±0.43,二者之间差异有统计学意义P<0.05。伴有门静脉侵润的Ferroportin蛋白表达阳性表达率和评分分别为9.10%,0.720.28；不伴有门静脉侵润其阳性表达率和评分分别为66.67%,1.03±0.47,二者之间差异有统计学意义P<0.05。Ferroportin表达和肝癌细胞的Edmondson-Steiner分级的关系:Ⅲ-Ⅳ期组中,Ferroportin蛋白的阳性表达率和阳性评分分别为20.00%,0.73±0.32；而在Ⅰ～Ⅱ期组中,其阳性表达率和阳性评分分别为35.29%,1.14±0.49,二者之间差异有统计学意义P<0.05。肝癌的TNM分期与Ferroportin蛋白表达之间也存在相似的相互关系。Ⅲ-Ⅳ期组中,Ferroportin蛋白的阳性表达率和阳性评分分别为19.23%,0.73±0.33；而在Ⅰ～Ⅱ期组中,其阳性表达率和阳性评分分别为35.79%,1.15±0.45,二者之间差异有统计学意义P<0.05。Ferroportin蛋白表达跟AFP水平之间没有明显的关系,P>0.05无统计学意义。Ferroportin在肝癌细胞系、正常肝细胞系中的表达情况：Western-blot实验显示：Ferroportin在各肝细胞癌细胞株表达明显减低,而肝正常细胞系中则表达增高,之间比较差异有统计学意义p<0.05,而肝癌细胞株中MHCC-97H中Ferroportin表达最低。成功构建了Ferroportin真核表达载体,并鉴定和Western-blot验证后将其转染入MHCC-97H细胞株中。生长曲线实验表明：转染了Ferroportin后,第1到4天的细胞生长数分别为：16750±5212、23445±6198、48377±4768、91642±7698,与对照组和未处理组比较之间差异有统计学意义,p<0.05。对照组第1到4天的细胞生长数分别为：21563.9±5860、47344.4±6379、89561.1±4870、155862±7980；未处理组第1到4天的细胞生长数分别为：22342±5490、45244±6523、90124±5062、149782±7120,二者之间比较差异无统计学意义,P>0.05。MTT实验结果显示：Ferroportin转染组0-96小时吸光率分别为：0.175±0.0447、0.267±0.0451、0.437±0.0567、0.765±0.0788、1.134±0.0853；而对照组24-96小时吸光率分别为：0.198±0.0479、0.356±0.0675、0.872±0.0345、1.421±0.0933、1.748±0.1012；未处理组的24-96小时吸光率分别为：0.202±0.0564、0.362±0.0764、0.843±0.0671、1.453±0.1392、1.752±0.1132。实验组与未处理组和对照组比较之间差异均有统计学意义,P<0.05,而未处理组与对照组比较之间差异无统计学意义,p>0.05。抑制率曲线显示：未处理组与对照组培养各时间的抑制率比较差异均无统计学意义(P>0.05)；三组细胞株培养0小时的抑制率无统计学意义(P>0.05),实验组与另外两组细胞株的抑制率比较24小时后的各时间点抑制率比较差异均有统计学意义(P<0.05),96h较72小时比较抑制率增加,但二者之间差异无统计学意义(P>0.05)。并培养72小时时的抑制率为31.12±7.87,抑制率>0.3,药敏试验阳性。划痕实验实验显示：Ferroportin转染组36小时细胞运动距离为268.0±28.94微米,而未处理组和对照组36小时细胞运动距离分别为483.0±24.08微米、479.0±23.18微米。实验组的迁移运动能力和未处理组比较,P<0.05有统计学意义。基质胶侵袭实验显示：未处理组、对照组中MHCC-97H细胞穿过基底膜的细胞数为每个视野平均172.0±33.43、162.0±30.43个；而转染Ferroportin后,MHCC-97H细胞穿过基底膜的细胞数明显减少,每个视野平均28.0±10.67个,实验组与未处理组、对照组比较,差异具有统计学差异,P<0.01。荧光测量法检测胞可变铁池(LIP)结果表明：未处理组、对照组MHCC-97H的LIP分别为0.3857±0.086、0.3746±0.091rfu；而实验组MHCC-97H细胞的LIP为0.1238±0.076rfu。实验组和未处理组、对照组比较,二者比较具有显著性差异,P<0.01。Western-blot检测Hepcidin对Ferroportin表达以及细胞内可变铁池LIP的影响显示：(1)分别使用0nM、300nM、700nM浓度的Hepcidin处理转染了Ferroportin的MHCC-97H细胞,Ferroportin的表达量分别为1.102±0.457,0.479±0.213,0.164±0.087,300nM、700nM组和0nM组Ferroportin的表达量比较差异有统计学意义,p<0.05,300nM与700nM组比较差异有统计学意义,p<0.05。(2)测定OnM、300nM、700nM浓度的Hepcidin处理实验组MHCC-97H细胞中的LIP,0nM、300nM、700nM Hepcidin处理后的LIP分别为0.1312±0.069、0.2576±0.081、0.3913±0.072,300nM、700nM组和0nM组LIP比较差异有统计学意义,p<0.05,300nM与700nM组比较差异有统计学意义,p<0.05。RT-PCR检测BMP/Smad信号通路对Ferroportin表达的影响：(1)不同种类BMP因子对Hepcidin表达结果显示未使用BMP处理的,其Hepcidin表达量比为0.978±0.145；BMP2、BMP4、BMP6处理后Hepcidin表达量比分别为：13.2600±1.2450、12.9340±1.3670、14.2300±2.1560；而使用BMP抑制剂组Hepcidin表达量比为0.0560±0.2360。BMP2、BMP4、BMP6处理后Hepcidin表达量与未使用BMP处理的、BMP抑制剂组Hepcidin表达量之间比较差异有统计学意义,P<0.05,(2)荧光定量PCR检测BMP2处理不同时间的Hepcidin的表达的结果表明：BMP2处理后0.5、1、2、4、6、12小时Hepcidin表达量比依次为1.423±0.356、2.534±0.215、5.871±0.534、8.314±1.098、14.23±1.230、18.240±1.780,各时间点之间比较差异均有统计学意义,P<0.05。Western-blot检测BMP2、BMP4、BMP6处理MHCC-97H细胞后Ferroportin表达情况：使用BMP2、BMP4、BMP6处理MHCC-97H细胞后其信号通路下游磷酸化的Smad(1/3/5)磷酸化程度明显增加,而使用BMP抑制剂组Smad (1/3/5)的磷酸化被明显抑制,BMP2、 BMP4、BMP6处理后Hepcidin表达量与未使用BMP处理的、BMP抑制剂组Ferroportin表达量之间比较差异有统计学意义,P<0.05。但是BMP家族成员2、4、6处理的Hepcidin表达量之间比较均无统计学意义,P>0.05。结论：1.Ferroportin在肝癌细胞中表达缺失和降低,Ferroportin的表达和Edmondson-Steiner分级、TNM分期、肝内转移以及门静脉侵润相关。2.Ferroportin在肝细胞癌细胞株表达明显减低,在肝正常细胞株中表达增高。3.成功构建了Ferroportin真核表达载体。4.在MHCC-97H细胞株中,Ferroportin的表达水平升高可以明显抑制MHCC-97H细胞的生长和侵袭转移。5. Ferroportin的高表达可以使肝癌细胞细胞内铁浓度明显降低。6. Hepcidin可以促进Ferroportin的细胞内降解,使得Ferroportin表达降低,从而使肝癌细胞中铁浓度明显升高。7.BMP家族成员2、4、6可以促进Hepcidin的表达增加,使Ferroportin的表达显著降低。